Sejumlah sampel (± 5 g) dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui bobotnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu 100⁰C hingga diperoleh bobot yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan berdasarkan bobot basah dengan menggunakan rumus :
(a-b)
Kadar air (% wb ) = x 100 %
c
Dimana : a = bobot cawan dan sampel awal (g) b = bobot cawan dan sampel akhir (g) c = bobot sampel awal (g)
b. Kadar Abu (AOAC 1995)
Cawan porselin dikeringkan dakam oven bersuhu 105-110 ⁰C, kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 5 g sampel ditimbang dan dimasukkan ke dalam cawan porselin. Selanjutnya sampel dipijarkan di atas nyala pembakar bunsun sampai tidak berasap lagi, kemudian dilakukan pengabuan di dalam tanur listrik pada suhu 400- 600⁰C selama 4-6 jam atau sampai terbentuk abu berwarna putih. Kemudian sampel didinginkan dalam desikator, selanjutnya ditimbang. Perhitungan kadar abu dilakukan dengan rumus :
bobot abu (g)
Kadar abu : x 100% bobot sampel (g)
c. Kadar Protein ( Metode Mikro- Kjeldahl AOAC1995)
Sejumlah kecil sampel (1-2 g ) ditimbang dan di masukkan ke dalam labu Kjeldahl. Kemudian ditambahkan 1,9 g K2SO4, 40 mg HgO, dan 2,0 ± 0,1 H2SO4. Sampel dididihkan selama 1-5 jam sampai cairan menjadi jernih.
Sampel didinginkan dan ditambah sejumlah kecil air secara perlahan- lahan. Isi tabung dipindahkan ke alat destilasi dan labu dibilas 5-6 kali
dengan 1-2 ml air. Air cucian dipindahkan ke labu destilasi dan ditambahkan 8-10 ml larutan NaOH- Na2SO3.
Erlenmeyer yang berisi 5 ml larutan H3BO3 dan 2 tetes indikator (campuran 2 bagian merah metil 0,2 persen dalam alkuhol) diletakkan di bawah kondesor. Isi erlenmeyer diencerkan sampai kira-kira 50 ml, kemudian dititrasi dengan HCl 0,02 N sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Penetapan untuk blanko juga dilakukan dengan prosedur yang sama tetapi tanpa sampel. Kadar protein dihitung dengan rumus : ( ml HCl sampel – ml HCL blanko )
%N = x N HCl x 14.007 x 100 bobot sampel (mg)
Kadar Proten (%) = % N x 6,25
d. Kadar Lemak (AOAC1995)
Labu lemak yang akan digunakan dikeringkan dalam oven bersuhu 105-110⁰C, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang sebanyak 5 g dibungkus dengan kertas saring dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi (soxhlet), yang telah berisi pelarut heksana.
Refluks dilakukan selama 5 jam (minimun) dan pelarut yang ada di dalam labu lemak didistilasi. Selanjutnya labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105⁰C hingga bobotnya konstan, didinginkan dalam desikator, dan ditimbang. Kadar lemak dihitung dengan rumus :
bobot lemak (g)
Kadar lemak = x 100% bobot sampel (g)
e. Kadar Karbohidrat (by difference ) (Apriyantono et al. 1989)
Kadar Karbohidrat (%) = ( 100% - (P + KA + A + L )) Keterangan : P = kadar protein (%)
KA = kadar air (%) A = kadar abu (%) L = kadar lemak (%)
f. Kadar mineral (SNI 1998)
Persiapan sampel dari analisis ini dilakukan dengan cara pengabuan basah, sedangkan prinsip pengukuran mineral dan logam bobot dilakukan dengan cara spektrofotometer. Pengabuan basah diawali dengan menimbang sejumlah sampel yang mengandung 5-10 g padatan dan dimasukkan ke dalam labu kjeldahl, sampek ditambahkan larutan H2SO4 sebanyak 10 ml dan larutan HNO3 sebanyak 10 ml (atau lebih) serta beberapa buah batu didih. Kemudian sample dipanaskan perlahan-lahan sampai larutan berwarna gelap, dihindari pembentukan buih yang berlebihan. Selanjutnya sampel ditambahkan 1-2 ml HNO3 dan pemanasan dilanjutkan sampai larutan lebih gelap lagi. Penambahan HNO3 dan pemanasan dilanjutkan selama 5-10 menit sampai larutan tidak gelap lagi (semua zat organik teroksidasi) kemudian didinginkan. Akuades sebayak 10 ml ditambahkan sampai larutan akan menjadi tidak berwarna atau menjadi kuning muda jika mengandung Fe, dan kemudian dipanaskan sampai berasap. Lalu larutan didinginkan dan diencerkan menggunakan labu takar 50 ml dengan menambahkan akuades sampai tanda tera lalu disaring dan dimasukkan kee dalam erlenmeyer kosong, lalu dianalisis kadar cemaran logam bobot dan mineralnya.
Kandungan mineral dan campuran bobot pada sampel dianalisa menggunakan Atomic Absortion Spectrophotometry (AAS). Sebelumnya dibuat pula larutan blanko yang berisi semua pereaksi yang digunakan, yaitu H2SO4 pekat, HNO3 pekat, larutan standar, larutan blanko dan larutan sampel dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 428,7 nm untuk kalsium (Ca), 248,3 nm untuk besi (Fe), 213,9 nm untuk seng (Zn), 235,5 nm untuk timah putih, 283,3 nm untuk timbal (Pb) (SNI 01-2896-1998). g. Kadar Serat (Sulaeman et al. 1994)
Sampel kering homogen diekstraksi lemaknya dengan petroleum eter pada suhu kamar selama 15 menit. Sejumlah 1 g sampel dimasukkan ke dalam Erlenmeyer kemudian ditambahkan 25 ml buffer fosfat pH 6 dan dibuat menjadi suspensi. Selanjutnya suspensi ditambahakan 0,1 ml enzim termamyl, ditutup dengan alufo dan diinkubasi pada suhu 100⁰C selama 15 menit, diangkat dan didinginkan dalam air mengalir. Air destilata
diitambahkan sebanyak 20 ml dan pH-nya diatur menjadi 6,8 dengan menambahkan naOH 4 M. Erlenmeyer ditutup dan dilakukan inkubasi pada suhu 40⁰C dan diagitasi selama 60 menit sambil diagitasi. Selanjutnya pH diatur kembali menjadi 4, 5 dengan HCL. Suspensi disaring dengan cruicible kering yang telah diketahui bobotnya (porositas 2) yang mengandung 0,5 g celite kering kemudian dicuci dengan 2 x 10 ml air destilata.
Residu padatan ( IDF) dicuci dengan 2 x 10 ml etanol 95 persen dan 2 x 10 ml aseton. Dikeringkan pada suhu 105⁰C (oven) sampai bobot tetap, kemudian ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (D1). Residu tersebut kemudian diabukan dalam tanur 500⁰CF selama paling sedikit 5 jam, kemudian ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (I1).
Volume filtrat (SDF) dimasukkan dalam labu ukur 100 ml dan tepatkan volumenya dengan menambahkan air destilata. Setelah tepat 100 ml dituang dalam wadah lain dan dimasukkan 400 ml etanol 95 persen hangat (60⁰C). Larutan tersebut diendapkan selama 1 jam. Disaring dengan cruicible kering (porositas 2) dengan mengandung 0,5 g celite kering yang telah diketahui bobot keringnya. Kemudian residu dicuci dengan 2x 10 ml etanol 78 persen, 2 x 10 etanol 95 persen dan 2 x 10 aseton. Residu dikeringkan dalam oven sampai diperoleh bobot tetap, kemudian ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (D2). Setelah itu residu tersebut diabukan dengan tanur 500⁰C, dan ditimbang setelah didinginkan dalam desikator (I2).
Serat makanan total diperoleh dengan menjumlahkan jumlah serat makanan larut dan tidak larut. Blanko untuk serat makanan larut dan tidak larut diperoleh dengan cara yang sama, tetapi tanpa sampel. Nilai blanko sekali-kali perlu diperiksa ulang, terutama jika menggunakan enzim dengan kemasan baru.
Rumus perhitungan nilai IDF dan SDF:
Nilai IDF (dalam persen bobot sampel kering): D1 - I1 - B1
= x 100% W
Nilai SDF (dalam persen bobot sampel kering): D2– I2– B2
= x 100% W
Keterangan :
W = bobot sampel (g)
D = bobot setelah analisis dan dikeringkan dalam oven (g) I = bobot setelah diabukan (g)
Lampiran 2. Prosedur Analisis Kandungan Bahan Aktif