3. BAHAN DAN METODE
3.4. Prosedur kerja
Bak pengamatan berupa 4 akuarium dipasang berjejer (sejajar), pada bagian atas 20 centimeter dari permukaan akuarium dipasang 2 buah besi sepanjang 50 centimeter. Pada kedua sisi besi tersebut dipasang 2 buah lampu TL. Kamera CCTV dirakit dengan menggunakan kawat besi tipis berukuran 23 centimeter yang dipasang menempel di atas piringan putih, kemudian kamera tersebut dihubungkan dengan komputer menggunakan kabel video sepanjang 5 meter. Ke dalam empat akuarium dimasukkan selang aerator yang digunakan untuk proses aerasi. Perakitan alat yang digunakan untuk penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 7.
3.4.2. Persiapan media penumbuh fitoplankton (Chlorella sp.)
Kotoran ayam sebanyak 1 sendok (2 mg) dimasukkan ke dalam 4 buah akuarium yang telah diisi dengan air aquades masing-masing 5 liter. Kotoran ayam dibungkus dengan kain, tujuannya agar kotoran ayam tidak menyebar dan air terlihat bersih. Batu karang dan kotoran ayam yang telah dibungkus kain diikatkan pada selang aerator agar selang aerator dan kotoran ayam dapat tenggelam ke dasar akuarium sehingga proses aerasi merata. Batu karang dan selang aerator tersebut dimasukkan ke dalam ke empat akuarium. Media yang telah disiapkan dibiarkan selama 1 minggu agar terjadi proses dekomposisi sehingga jumlah nitrat dalam media tidak terlalu banyak.
3.4.3. Isolasi fitoplankton (Chlorella sp.)
Bibit Chlorella sp. yang akan ditumbuhkan terlebih dahulu diisolasi atau dipisahkan dari jenis organisme lain dengan cara mengamatinya menggunakan mikroskop. Tujuannya adalah untuk mendapatkan bibit Chlorella sp. murni. Pada tahap isolasi ini Chlorella sp. yang diambil 10 mililiter dari media inokulan diamati di bawah mikroskop. Organisme jenis lain dipisahkan dari inokulan
Chlorella sp. tersebut. Inokulan yang telah murni dimasukkan ke dalam wadah
berukuran 50 mililiter. Inokulan Chlorella sp. yang diperoleh, dimasukkan ke dalam media penumbuh yang telah disediakan.
3.4.4. Penentuan kelimpahan fitoplankton (Chlorella sp.)
Fitoplankton (Chlorella sp.) yang diperoleh dari hasil isolasi, dimasukkan ke dalam 50 mililiter akuades dan dihitung kelimpahan awalnya. Kelimpahan awal diperoleh dengan menghitung jumlah Chlorella sp. yang ditemukan pada 9 kotak besar hemacytometer dengan menggunakan mikroskop. Hemacytometer merupakan suatu alat yang terbuat dari gelas yang dibagi menjadi kotak-kotak pada dua tempat bidang pandang. Kotak tersebut berbentuk bujur sangkar dengan sisi 1 milimeter dan tinggi 0,1 milimeter sehingga apabila ditutup dengan gelas penutup volume ruangan yang terdapat diatas bidang adalah 0,1 mm3 atau 10-4 mililiter.
Jumlah total kotak besar ada sebanyak 9 buah dan di dalam 9 kotak besar terdapat masing-masing 16 kotak kecil. Jumlah total Chlorella sp. dikalikan dengan jumlah total kotak dibagi dengan banyaknya jumlah kotak yang diamati kemudian dikalikan dengan 104 mililiter. Setelah diketahui kelimpahan awalnya, fitoplankton tersebut dimasukkan ke dalam media yang telah disediakan.
Cara menghitung jumlah Chlorella sp. pada hemacytometer dapat dilihat pada Gambar 6. Kelimpahan Chorella sp. dihitung setiap hari dengan mengambil masing-masing 10 mililiter air sampel dari tiap-tiap akuarium. Air yang telah diambil dimasukkan ke dalam botol sampel kemudian ditetesi dengan lugol sebanyak 3 tetes pada tiap-tiap botol sampel. Pemberian lugol dilakukan agar
Chlorella sp. mati, sehingga pembelahan sel tidak terjadi.
Kotak yang diamati
Sumber : Alim dan Kurniastuty, 1995
Gambar 6. Pola kotakan pada hemacytometer dan contoh arah perhitungannya
Air sampel diteteskan pada permukaan hemacytometer yang telah ditutupi
cover glass sampai permukaan hemacytometer ditutupi air sampel. Selanjutnya
hemacytometer tersebut diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali. Penentuan jumlah Chlorella sp. dapat diketahui dengan cara menghitung
banyaknya jumlah Chlorella sp. yang terdapat dalam 9 kotak besar yang
mempunyai sisi 1 milimeter pada hemacytometer. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk mengetahui besarnya kelimpahan Chlorella sp. Pengamatan dilakukan
sampai kelimpahan Chlorella sp. cenderung stabil atau sampai air dalam akuarium pengamatan berubah warna dari jernih menjadi sangat hijau.
Kelimpahan fitoplankton (Chlorella sp.) dihitung menggunakan persamaan berikut (Eaton et al., 1995):
Keterangan: N = Kelimpahan individu (sel/ml) n = Jumlah sel
16 = Jumlah total kotak kecil
∑Kbi = Jumlah kotak kecil yang diamati pada hemacytometer 10-4 = Volume air sampel yang menutupi 1 kotak besar pada
hemacytometer (ml)
3.4.5. Teknik pengambilan gambar
Gambar diperoleh dengan menggunakan kamera CCTV. Kamera yang dipasang pada piringan putih dimasukkan ke dalam akuarium sehingga kamera berada pada jarak lebih kurang 10 centimeter dari obyek pengamatan (Gambar 7). Kamera dihubungkan dengan komputer menggunakan kabel video sepanjang 5 meter. Pengambilan gambar dilakukan pada komputer menggunakan program
Honestec TV.
Citra diperoleh dari hasil pemotretan pada permukaan air bak pengamatan (akuarium). Pada saat pengambilan gambar, aerator dimatikan tujuannya untuk menghindari riak air pada saat pengambilan gambar. Gambar yang telah diperoleh melalui pemotretan langsung tersimpan di komputer secara otomatis. Pengambilan gambar dilakukan satu kali setiap hari selama 24 hari.
4 16 1 10 1 16 − = × × =
∑
i i Kb n N
Piringan putih Lampu TL Bak pengamatan Komputer Kamera CCTV
Gambar 7. Teknik pengambilan gambar (citra) media pengamatan (Chlorella sp.)
3.4.6. Teknik pengolahan citra
Gambar yang diperoleh dari hasil pemotretan dapat dibuka dan diolah menggunakan software Adobe Photoshop. Pada gambar yang diperoleh dari hasil pemotretan terdapat cahaya putih, cahaya putih tersebut adalah bayangan lampu yang digunakan sebagai penerangan. Pada gambar yang akan dianalisis terlebih dahulu dilakukan cropping sebanyak 3 x 3 grid atau 9 grid (Gambar 8). Proses
cropping bertujuan menghilangkan pengaruh pantulan cahaya oleh permukaan air,
supaya cahaya lampu tersebut tidak dihitung nilai intensitasnya. Hasil cropping dipindahkan ke halaman dan lembar baru (Gambar 9).
Spesifikasi lembar baru yang digunakan untuk menempatkan citra hasil
cropping dapat dilihat pada Gambar 9. Nilai intensitas sinar merah, hijau, dan
biru diketahui dengan melihat nilai yang tertera pada histogram (Gambar 10). Data yang disajikan pada histogram terdiri dari level intensitas dan frekuensi kejadian. Level intensitas pada tiap-tiap kanal histogram berkisar antara 0 – 255. Frekuensi kejadian yang disajikan pada level intensitas tertentu adalah data pantulan sinar merah, hijau, dan biru oleh obyek pengamatan.
Gambar 8. Cropping obyek pengamatan (konsentrasi Chlorella sp.) pada Adobe
Photoshop
Gambar 9. Analisis sinar merah, hijau, dan biru (RGB) serta spesifikasi lembar baru pada Adobe Photoshop
Spesifikasi lembar baru
Gambar 10. Analisis intensitas sinar merah, hijau, dan biru (RGB) pada histogram Adobe Photoshop
3.4.7. Pengukuran panjang gelombang lampu TL
Lampu TL yang digunakan untuk penyinaran obyek pengamatan (Chlorella sp.) diukur intensitas relatifnya menggunakan spektrofotometer . Spektrofotometer yang dipakai adalah USB spektrofotometer S 2000. Lampu yang akan diukur dinyalakan dan sensor spektrofotometer didekatkan. Hasil pengukuran akan berupa intensitas relatif gelombang yang dipancarkan pada tiap panjang gelombang dan disajikan dalam bentuk grafik. Sinar lampu TL berbentuk grafik sinar Visible.
Karakteristik sinar-sinar yang lain diketahui dengan menggunakan filter yang sesuai dengan warna yang akan diamati. Filter didekatkan pada lampu TL dan sensor optik juga didekatkan sehingga melalui software spektrofotometer yang ada pada komputer dapat diketahui panjang gelombang dan intensitas sinar .
Intensitas sinar merah, hijau, dan biru (RGB) pada kanal Citra hasil cropping
Filter merah digunakan untuk menentukan nilai panjang gelombang dan intensitas relatif pada sinar merah, filter hijau digunakan untuk sinar hijau dan filter biru digunakan untuk melihat panjang gelombang dan intensitas relatif sinar biru. Filter berfungsi menyerap warna lain yang dipancarkan oleh lampu TL sehingga yang disalurkan adalah warna yang sesuai dengan warna filter.
3.4.8. Analisis data
Pergeseran warna dilihat pada histogram melalui kanal-kanal pada tiap perlakuan. Pergeseran warna dapat dilihat secara visual. Pada sumbu horizontal histogram terdapat level intensitas dan pada sumbu vertikal terdapat frekuensi kejadian. Pergeseran ke kanan menunjukkan terjadinya peningkatan intensitas warna dan pergeseran ke kiri menunjukkan terjadinya penurunan intensitas warna (Gambar 11). Dalam analisis data, presentasi kuat cahaya diukur dalam unit absorbansi. Absorbansi merupakan perbandingan energi yang diserap dan dilepaskan oleh suatu bahan. Energi yang diukur berupa photon atau flux persatuan luasan. Besarnya nilai absorbansi oleh Chlorella sp. diperoleh dengan cara mencari selisih nilai level intensitas maksimum yakni 255 terhadap nilai pantulan yang diberikan oleh permukaan air.
Gambar 11. Pergeseran intensitas warna yang dipantulkan oleh konsentrasi
Perbandingan antara satu perlakuan dengan perlakuan yang lain dilakukan dengan analisis regresi. Analisis regresi yang dipakai adalah analisis regresi multivariat. Analisis regresi dapat digunakan untuk memutuskan apakah naik dan menurunnya variabel dependen dapat dilakukan melalui menaikkan dan
menurunkan keadaan variabel independen, atau untuk meningkatkan keadaan variabel dapat dilakukan dengan meningkatkan variabel independen dan
sebaliknya sehingga dapat diketahui variabel-variabel yang saling mempengaruhi. Persamaan pada analisis regresi untuk tiga prediktor adalah sebagai berikut (Sugiyono, 2006):
Keterangan:
Y = Peubah tak bebas ( Kelimpahan Chlorella sp.) X1 = Peubah bebas ke-1 (Intensitas sinar merah) X2 = Peubah bebas ke-2 (Intensitas sinar hijau) X3 = Peubah bebas ke-3 (Intensitas sinar biru) a = Intercept
b1, b2, b3 = Slope
Untuk mengetahui tingkat korelasi ganda dengan tiga prediktor digunakan persamaan berikut (Sugiyono, 2006):
Keterangan: Ry (1, 2, 3) = korelasi antara peubah bebas 1, 2, 3 dengan Y
3 3 2 2 1 1x b x b x b a Y = + + +