TINJAUAN PUSTAKA
4. Ekstraksi energi listrik
3.4. PROSEDUR KERJA
3.4.1. Penyiapan Simplisia dan Pembuatan Ekstrak
Sebanyak 155 gr herba kemangi (Ocimum americanum L.) yang berwarna hijau segar. Herba kemangi yang telah dikumpulkan kemudian dicuci bersih lalu dirajang kecil-kecil untuk diekstraksi dengan blender menggunakan pelarut air (fresh pressed juice). Hasil ekstraksi kemudian disaring lalu dikeringkan dengan freezedryer selama 3-4 hari untuk menarik sisa kandungan air yangmasih terdapat didalam ekstrak.
Nilai hasil rendemen ekstrak dihitung dengan rumus sebagai berikut :
% � = � �
� � � � � � 100%
3.4.2. Penapisan Fitokimia Ekstrak 1. Identifikasi Alkaloid
Ekstrak dilarutkandengan HCl encer dan disaring.
a. Uji mayer : Filtrat ditambahkan reagen mayer, terbentuk endapan berwarna kuning menunjukkan adanya alkaloid.
b. Uji wagner : Filtrat ditambahkan reagen wagner, terbentuk endapan coklat/kemerahan menunjukkan adanya alkaloid.
c. Uji dragendroff : Filtrat ditambahkan reagen dragendroff, terbentuk endapan merah menunjukkan adanya alkaloid (Tiwari et al., 2011). 2. Identifikasi Saponin, Uji busa/bath
0,5 g ekstrak ditambahkan 5 ml air suling dalam tabung reaksi. Larutandikocok kuat-kuat dan buih yang stabil diamati. Buih tersebut dicampur dengan 3 tetes minyak zaitun dan dikocok kuat-kuat setelah itu diamati apabila terjadi pembentukan emulsi.(Ayoola et al., 2008)
3. Identifikasi Flavonoid
Ekstrak ditambahkan beberapa tetes larutan NaOH, terbentuk warna kuning yang pekat. Warna kuning menghilang bila dilakukan penambahan beberapa tetes asam encer menunjukkan adanya flavonoid (Tiwari et al., 2011). 4. Identifikasi Tanin
Sekitar 0,5 g ekstrak direbus dalam 10 ml air dalam tabung reaksi dan kemudian disaring. Beberapa tetes 0,1% feri klorida (FeCl3) ditambahkan
dan diamati dimana tannin terhidrolisa memberikan warna biru atau biru-hitam, sedangkan kondensasi tannin memberikan warna biru-hijau. (Ayoola et al., 2008)
3.4.3. Pengujian Parameter Spesifik dan Non Spesifik 3.4.3.1. Parameter spesifik
Identitas ekstrak. Deskripsi tata nama : Nama ekstrak (generik, dagang, paten) Nama latin tumbuhan (sistematika Botani) Bagian tumbuhan yang digunakan
Nama Indonesia tumbuhan. (Depkes RI, 2000)
Organoleptik. Penggunaan pancaindera mendeskripsikan bentuk, warna, bau, rasa sebagai berikut :
Bentuk : padat, serbuk-kering, kental, cair. Warna : kuning, coklat, dll.
Bau : aromatik, tidak berbau, dll. Rasa : pahit, manis, kelat, dll. 3.4.3.2. Parameter non spesifik
a. Kadar abu
Prosedur: Lebih kurang 2 g sampai 3 g ekstrak yang telah digerus dan ditimbang secara seksama dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, ratakan. Pijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, timbang. Jika cara ini arang tidak dapat dihilangkan, tambahkan air panas saring melalui kertas saring bebas abu. Pijar kan sisa kertas dan kertas saring dalam krus yang sama. Masukkan filtrate ke dalam krus, uap kan, pijar kan hingga bobot tetap, timbang. Hitung kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara. (Depkes RI, 2000)
3.4.4. Penyiapan Hewan Coba
Tikus jantan diaklimatisasi di laboratorium farmakologi selama 1 minggu. Diberi makan dan minum secara ad libitum (sesuai dengan kebutuhan) serta ditimbang berat badannya.Ekstrak air herba kemangi diberikan secara oral menggunakan sonde sekali setiap hari yaitu pada pagi hari selama 48 hari dengan dosis seperti yang tertera pada tabel rancangan percobaan (Tabel 1). Pada hari ke-49 masing-masing kelompok tikus dibius dengan eter hingga tahap anestesi, kemudian dibedah dan diambil testis dan cauda epididimisnya.
3.4.5. Pembuatan Preparat
Setelah 48 hari, masing-masing hewan coba dikorbankan untuk diambil organ testisnya. Tikus dibius dengan eterhingga tahap anestesia (pembedahan), kemudian dibedah. Diambil bagian cauda epididimis dan dihitung jumlah spermatozoa kemudian bagian testis diambil untuk ditimbang dan dibuat preparat. Pembuatan sediaan mikroanatomi testis dilakukan di Laboratorium Patologi AnatomiFakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Pembuatan preparat dilakukan dengan cara : testis yang telah diambil, difiksasi dalam larutan Bouin, kemudian didehidrasi dengan etanol seri bertingkat, dan pada akhirnya ditanamkan dalam paraffin wax. Blok paraffin dipotong dengan ketebalan 5µm dan dilakukan pewarnaan dengan hematosiklin –eosin (Yotarlai et al., 2011).
3.4.6. Pengukuran Parameter 3.4.6.1. Morfologi Sperma
Sebanyak50 µl suspensi sperma dimasukkan ke tabung reaksi kemudian ditambahkan 300 µl eosin Y 1%dan dicampur secara perlahan dengan menggunakan pipet. Sperma diinkubasi pada suhu kamar selama sekitar 45-60 menit untuk memaksimalkan pewarnaan (Anonimous, 2000).
3.4.6.2. Bobot Testis
Pengukuran bobot testis dilakukan dengan cara menimbang organ testis dengan timbangan analitik kemudian hasil bobot testis tikus yang diberikan perlakuan dibandingkan dengan bobot testis tikus kontrol.
3.4.6.3. Perhitungan Konsentrasi Spermatozoa
Pengukuran konsentrasi spermatozoa dilakukan dengan cara mengambil spermatozoa pada cauda epididimis. Spermatozoa yang didapat diletakkan pada kaca arloji yang berisi cairan NaCl fisiologis 0.9% sebanyak 250 μL. Spermatozoa dimasukkan kedalam bilik hitung Neubauer (Hemasitometer) sampai kamar Neubauer terisi rata. Kemudian dihitung jumlah spermatozoa pada salah satu kamar hitung Neubauer dan selanjutnya ditentukan pengenceran yang akan dilakukan dan jumlah kotak yang akan dihitung (Tabel 3.2).
Tabel 3.2. Pengenceran yang dilakukan dan kotak yang dihitung No Jumlah spermatozoa
dalam 1 kotak Pengenceran Kotak yang dihitung
1 > 40 50 kali 5
2 15 – 40 20 kali 10
3 < 15 10 kali 25
Dari jumlah spermatozoa yang diketahui, maka dilakukan pengenceran spermatozoa berdasarkan jumlah spermatozoa yang terhitung (Ilyas, 2007).
Tabel 3.3. Cara pengenceran
No Pengenceran Pembuatan pengenceran
1 50 kali a. 980 μL larutan George + 20 μL spermatozoa b. 2.450 μL larutan George + 50 μL spermatozoa 2 20 kali 950 μL larutan George + 50 μL spermatozoa 3 10 kali a. 900 μL larutan George + 100 μL spermatozoa
b. 450 μL larutan George + 50 μL spermatozoa
Poin a dan b menunjukan opsi perlakuan (hanya salah satu yang dipilih).
Setelah dilakukan pengenceran, dilakukan perhitungan spermatozoa dengan jumlah kotak yang dihitung sesuai dengan jumlah spermatozoa dan cara pengenceran pada tabel diatas. Kemudian dilakukan pengukuran spermatozoa sesuai rumus di bawah ini (Ilyas, 2007).
� = × 10.000 ×� ×25× �
Keterangan: n adalah jumlah spermatozoa yang terhitung. Angka 10.000 merupakan volume kamar hitung Neubauer. Fp merupakan faktor pengenceran yang dilakukan. Angka 25 menunjukan total kotak kecil yang terdapat dalam kamar hitung Neubauer sedangkan k merupakan jumlah kotak kecil yang dihitung pada saat pengamatan. vNaCl merupakan volume NaCl (mL) fisiologis yang digunakan untuk membantu mengeluarkan spermatozoa dari vas deferens. Perhitungan konsentrasi spermatozoa (Juta/mL) dapat terlihat dari tabel 3.4 berikut.
Tabel 3.4. Rumus Konsentrasi Spermatozoa
No Jumlah kotak yang dihitung Rumus konsentrasi spermatozoa
1 5 n x 10.000 x 50 x 5 x 0,25
2 10 n x 10.000 x 20 x 2,5 x 0,25
3 25 n x 10.000 x 10 x 1 x 0,25
Dari perhitungan jumlah spermatozoa, dapat dihitung pula frekuensi timbulnya azoospermia. Azoospermia adalah suatu keadaan dimana tidak ada spermatozoa dalam cairan semen. Sedangkan oligozoospermia adalah suatu keadaan dimana terdapat sedikit spermatozoa dalam cairan semen (spermatozoa ≤ 20 juta/mL) (WHO, 1999). Penetapan timbulnya azoospermia dilakukan dengan cara membagi banyaknya individu yang mengalami azoospermia (Az) dengan banyaknya individu dalam satu kelompok (n) dikalikan 100% (Kusmana, 2001).
Persentase Azoospermia = x 100%
3.4.6.4. Pengukuran Diameter Tubulus Seminiferus
Preparat histologi testis tikus diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali (10 x 10) kemudian difoto. Pengukuran diameter dilakukan pada 100 tubulus seminiferus yang terpotong bundar dan dipilih secara acak.
3.4.6.5. Tebal Sel Germinal
Preparat histologi testis tikus diamati dibawah mikroskop denganpembesaran 100 kali (10 x 10) kemudian difoto. Pengukuran ketebalan sel germinal dilakukan pada 100 tubulus seminiferus yang terpotong bundar dan dipilih secara acak.
