Pengecatan gram dilakukan dengan cara mengambil satu ose dari masing-masing isolat bakteri tanah naungan,lalu diletakkan pada gelas preparat, diratakan, lalu difiksasi sebentar di atas api bunsen (± 5 detik). Setelah itu isolat bakteri ditetesi larutan gram A 3 tetes dan didiamkan selama 1
menit, lalu dibilas dengan akuades, kemudian ditetesi kembali dengan larutan Gram B 3 tetes dan didiamkan selama 1 menit, lalu dibilas. Setelah itu diteteskan larutan Gram C 3 tetes, diamkan selama 30 detik, lalu dibilas dengan akudes. Lalu diteteskan dengan larutan Gram D 3 tetes, diamkan selama 2 menit, setelah itu dibilas dengan akuades dan dikeringanginkan. Dikatakan Gram positif jika hasil pengecatan berwarna ungu, dan Gram negatif jika berwarna merah.
2. Pengecatan Spora
Pengecatan spora dilakukan dengan cara mengambil satu ose dari masing-masing isolat bakteri tanah naungan,lalu diletakkan pada gelas preparat, diratakan, lalu difiksasi dengan melewatkannya di atas bunsen sebanyak 10 kali. Kemudian preparat tersebut ditetesi catmalachite greendan didiamkan selama 10 menit, setelah itu dibilas dengan aquades dan
dikeringanginkan. Membedakan endospora dan sel vegetatif, diberikan cat penutup yaitu larutansafraninselama 5 detik kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringanginkan. Hasil pengecatan ini akan menunjukkan spora tampak berwarna hijau, sedangkan sel vegetatifnya berwarna merah.
3. Uji Katalase
Uji katalase dilakukan dengan mengambil satu mata jarum ose koloni bakteri dari stok kultur, kemudian dioleskan pada gelas objek. H2O2 diteteskan pada preparat bakteri tersebut kemudian diamati keberadaan gelembung udara (O2) yang timbul setelah bakteri ditetesi H2O2tersebut.
Contoh tahapan uji katalase dapat dilihat pada Gambar 3a. Uji katalase dikatakan positif bila terjadi gelembung udara (O2), sedangkan dikatakan negatif bila tidak terjadi gelembung udara (Gambar 3b).
(a) (b)
Gambar 3. (a) Tahapan Uji Katalase, (b) Contoh Hasil Uji Katalase Sumber: Pradhika (2010)
4. Uji Motilitas
Uji motilitas dilakukan dengan mengambil satu ose masing-masing isolat bakteri tanah naungan dengan ose runcing, lalu ditusukkan secara lurus atau vertikal pada media NA padat yang telah disiapkan pada tabung reaksi, kemudian diinkubasi 2 hari dalam inkubator. Dikatakan motil jika pertumbuhan koloni bakteri menyebar, sedangkan non-motil jika
5. Uji Toksisitas
Uji toksisitas dilakukan dengan menggunakan ulat (larva Lepidoptera). Ulat tersebut dimasukkan dalam wadah dan diberikan makanan berupa daun yang telah dioleskan dengan isolatBt. Wadah tersebut ditutup menggunakan plastik dan dilubangi secukupnya untuk saluran udara. Uji toksisitas ini dilakukan selama 72 jam.
6. Perhitungan Sel Bakteri secara Langsung (Mikroskopis)
Perhitungan sel bakteri secara mikroskopis dilakukan dengan membuat pengenceran. Pengenceran pertama (10-1) diperoleh dengan mengambil 1 ml suspensi bakteri kemudian ditambahkan ke dalam 9 ml aquades dan dihomogenkan mengunakan vortek selama 1-2 menit. 1 ml dari
pengenceran pertama ditambahkan ke dalam 9 ml aquades berikutnya sehingga diperoleh pengenceran 10-2, kemudian dari pengenceran 10-2 diambil 0,01 ml suspensi bakteri dan diletakkan pada gelas objek yang berukuran 1 cm X 1 cm dan dilakukan pengecatan gram. Perhitungan kepadatan sel bakteri secara langsung dilakukan dengan melihat jumlah sel pada luas lapang pandang mikroskop. Penentuan luas lapang pandang mikroskop dilakukan dengan mengukur diameter areal pandang mikroskop menggunakan mikrometer objektif yang mempunyai skala terkecil 0,01 mm. Nilai diameter areal pandang mikroskop digunakan untuk
Luas areal pandang mikroskop =
Dimana r= jari-jari areal pandang mikroskop
Sedangkan rumus penentuan perhitungan kepadatan sel bakteri secara langsung yaitu sebagai berikut:
Konsentrasi Sel =
( ) ( )
7. Pengaruh pH
Uji pengaruh pH terhadap isolatBacillus thuringiensis(kuantitatif) dilakukan dengan menggunakan media cair Nutrient Broth (NB) yang diatur pada pH dengan perlakuan pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8. Masing-masing perlakuan diinokulasi kultur isolatBacillus thuringiensis/ bakteri uji sebanyak 106CFU/ml. Sebagai kontrol adalah media NB cair tanpa penambahan bakteri. Kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam suhu 37oC. Pertumbuhan sel ditentukan berdasarkan absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-vis pada panjang gelombang 620 nm.
8. Pengaruh Suhu
Uji pengaruh suhu terhadap pertumbuhan isolatBacillus thuringiensis (kuantitatif) dilakukan menggunakan media cair yaitu Nutrient Broth (NB) yang disterilisasikan dengan ketetapan pH optimum pertumbuhan,
kemudian diinokulasi dengan kultur isolatBacillus thuringiensis/ bakteri uji sebanyak 106CFU/ml. Kemudian diinkubasi pada variasi suhu 20oC, 30oC, 40oC, 50oC, dan 60oC selama 24 jam. Sebagai kontrol adalah media NB cair tanpa penambahan bakteri. Pertumbuhan sel ditentukan
berdasarkan abso panjang gelom E. Tahapan Peneliti Gambar 4. Diagram A Identifika Isola Uji Katalase Uji Toksisitas Spektrofotometer = Pengar pH 7, da Pengar 50oC, da Uji Motilitas
absoransi menggunakan spektrofotometer UV-ombang 620 nm.
litian
Alir Tahapan penelitian
Penge Gram Pen Spo P Kr
ifikasiBacillus thuringiensis
solatBacillus thuringiensis
Spektrofotometer = Pembuatan Kurva Standar aruh pH ( pH 4, pH 5, pH 6, 7, dan pH 8) aruh suhu (20oC, 30oC, 40oC, , dan 60oC) V-vis pada gecatan m engecatan pora Pengecatan Kristal Protein Spektrofotometer = 620 nm urva
I. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Kesimpulan dari hasil penelitian yang telah dilakukan adalah sebagai berikut: 1. Berdasarkan identifikasi terhadap 9 isolat bakteri tanah terdapat 3 isolat
yaitu isolatBtPBG1,BtPBR1, danBtPML yang menunjukkan karakter Bacillus thuringiensis yaitu bersifat toksik terhadap ulat, menghasilkan enzim katalase dan bersifat motil.
2. IsolatBtPBG1,BtPBR1, danBtPML merupakan golongan bakteri mesofilik dengan pertumbuhan sel optimum terletak antara suhu 30oC dan 40oC.
3. IsolatBtPBG1,BtPBR1, danBtPML tumbuh dengan baik pada pH basa yaitu dengan perkiraan pH 7,5 pada isolatBtPBG1, pH >8 pada isolatBt PBR1, dan pH 7,4 pada isolatBtPML.
B. Saran
Berdasarkan hasil penelitian uji toksisitas, uji katalase, uji motilitas, pengaruh suhu dan pH terhadap pertumbuhan isolatBtPBG1,BtPBR1, danBtPML belum cukup untuk menentukan perbedaan karakter fisiologi Bacillus thuringiensis. Selanjutnya perlu diadakan penelitian mengenai
karakteristik fisiologi dengan melihat bentuk-bentuk kristal protein untuk mengetahui perbedaan dari isolatBtPBG1,BtPBR1, danBtPML.
DAFTAR PUSTAKA
Abdurachman, A., K. Nugroho, dan S. Karama. 1998. Optimalisasi pemanfaatan sumber daya lahan untuk mendukung program Gema Palagung 2001.
Prosiding Seminar Nasional dan Pertemuan Tahunan Komda HITI 1998.
Buku 1. hlm. 1-11.
Ahdianto D. F. 2006. Kajian Pengaruh ph dan Suhu Terhadap Produksi
Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis subsp.israelensis Menggunakan Substrat Onggok Tapioka.SkripsiFakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Bahagiawati. 2002. PenggunaanBacillus thuringiensis sebagai Bioinsektisida. Buletin Agrobio 5(1): 21-28. Bogor.
Benson, H. J. 2002.Microbiology Applications Laboratory Manual in General Microbiological,. Mc Graw Hill Companies, New York.
Bernhard K., R. Utz. 1993. Production ofBacillus thuringiensis Insecticides for Experimental and Commeercial Uses. Di dalam P. F. Entwilse, J. S. Cory, M. J. Bailey dan S. Higgs (Penyunting).Bacillus thuringiensis an Enviromental Biopesticide theory and Practice.John Wiley and Sons, Chichester.Hlm. 255-265.
Buchner, G. E. 1981.Identification of Bacteria Found in Insect. Di dalam H. D. Gurges (editor). Microbial Control Pest and Plant Disease 1970-1980. Academic Press, New York.
Carozzi, N.B., V.C. Kramer, G.W. Warren, S. Evola, and M.G. Koziel. 1991. Prediction of insecticidal activity ofBacillus thuringiensisstrains by polymerase chain reaction product profiles.Appl. Environ. Microbiol. 57: 3057–3061.
Deacon J . W. 1983.Microbial Control of Plant and Diseases. Van Nostrand Reinhold (VK) Co, Ltd.
Dulmage, H. T. 1981.Insecticidal Activity of Isolated of Bacillus thuringiensis and Their Potential for Pest Control. Dalam H. D. Burges (editor). Microbial Control of Pest and Plant Disease 1970–1980. Academic Press, New York.
Dulmage, H. T., J. A. Corea dan G. G. Morales. 1990. Potential for Improved Formulation of Bacillus thuringiensis israelensis through Standarization and Fermentation Development. Dalam H. de Barjac dan D. J.
Surtherland (editor).Bacterial Control of Mosquitos and Blackfleis : Biochemistry, Genetic and Application of Bacillus thuringiensis israelensis & Bacillus sphaericus. Rotgers University Press. New Brunswick, New Jersey, USA : 110-133.
Ellar, D.J. dan B. Promdonkoy. 2000. Membrane Pore Architecture of A Cytolitycoxin fromBacillus thuringiensis.Biochemical Journal. 350, 275-282.
Feitelson, J. S., Payne, L. Kim. 1992.Bacillus thuringiensis: Insects and Beyond. Biotechnology. 10 : 271–275. Dalam Bahagiawati (2002). Penggunaan Bacillus thuringiensissebagai Bioinsektisida.Bulletin Agrobio5 (1) : 21-28.
Gill, S. S., E. A. Cowles dan P. V. Pietrantonio. 1992.The Mode of Action of Bacillus thuringiensis. Endotoxin. Annu, Rev. Entomol. 37 : 615-636. Gumbira-Sa’id, E. 1987.Bioindustri. Mediyatama Sarana Perkasa, Jakarta. Hidayat, Nur. 2006.Mikrobiologi Industri.Andi Yogyakarta. Yogyakarta. Ketaren, S. 1990.Kinetika Reaksi Biokimia. Departemen Pendidikan dan
Kebudayaan. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi PAU Bioteknologi. IPB, Bogor.
Klein E, DL.Smith, Laxminarayan. 2007. Hospitalizations and Deaths Caused by Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, United States, 1999–2005. Emerg Infect Dis13 (12): 1840–6.
Lay, B. W. and Hastowo. 1992.Mikrobiologi.Rajawali Press. Jakarta. Lay, B. W. 1994.Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada.
Jakarta.
Madigan, T.M., J.M. Martinko, P.V. Dunlap, and D.P. Clark. 2009.Biology of Microorganisms. Ed ke 12. Pearson Benyamin Cummings. San Fransisco. Hlm: 149, 390, 624.
Milne, R. AZ. Ge. De. Rivers, and D. H. Dean. 1990.Specificity of Insecticidal Crystal Proteins : Implication for Industrial Standardization. Dalam Hickle, L. A. dan W. L. Petch (Editor). Analytical Chemistry ofBt. American Chemical Society. Washington DC.
Nurwijayanti, R. 2005. Daya Bunuh Bacillus thuringiensis Isolat Bangkalan Madura terhadap Berbagai Instar Larva Nyamuk.SkripsiJurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Brawijaya. Malang.
Pelczar, M. J. and Chan E. C. S. 2008.Dasar-dasar Mikrobiologi. Jilid 1. Hadioetomo (penerjemah), Terjemahan dari:Elements of Microbiology. UI press. Jakarta.
Petras, S. F. and L. E. Casida. 1985. Survival of Bacillus thuringiensis spores in soil.Appl. Environ. Microbiol.50: 1496-1501.
Shieh, T. R. 1994. Identification and Clasification of Bacillus thuringiensis. DalamKumpulan Makalah Seminar Bacillus thuringiensis. Komisi Pestisida, Departemen Pertanian. Jakarta.
Sriganti E.2000. ToksisitasBacillus thuringiensis subspberlinerdansubs aizaway Terhadap LarvaCrocodoloma binotalis zell(Lepidoptera: Pyralidae) dan Spodopteralitura(Lepidopotera;Noctuidae).SkripsiFakultas MIPA Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Suryani, Y. Astuti, B. Oktavia, dan S. Umniyati. 2010.Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Limbah Kotoran Ayam Sebagai Agensi
Probiotik dan Enzim Kolesterol Reduktase.Prosiding Seminar Nasional Biologi. 138-147
Sutedjo, M. M., A. G. Kartasapoetra, R. D. S. Sastroadmodjo. 1996.Mikrobiologi Tanah. Penerbit Rinekha Cipta, Jakarta.
Swadener, C. 1994. Bacillus thuringiensis. Journal of Pesticides Reform vol. 14, No 3: 13-20. Northwest Coalition for Alternative to Pesticides.Ottawa. Taruminkeng, Rudy C. 2001.Makalah Falsafah Sains (Pps 702). Program
Pascasarjana/S3. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Trizelia. 2001.Makalah Falsafah Sains(PPs 702). Program Pascasarjana/SC. Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Zeigler, D. R. 1999.Bacillus Genetic Stock Center of Strains, Part 2:Bacillus thuringiensis dan Bacillus Cereus.The Ohio State University. USA.
Lampiran 1.Hasil Uji Absorbansi Pertumbuhan Sel Standar Tabel 5. Data hubungan jumlah sel dengan absorbansi 620nm
Absorbansi Jumlah sel
0,161 3,075
0,121 2,075
0,064 1,075
0,038 0,075
Persamaan regresi menggunakan metode Least Square Y = a + bx
Y = jumlah sel
X = nilai absorbansi pada panjang gelombang 620 nm
=
( )( )
( ) ( )²
a =Y̅-bX̅
Tabel 6. Perhitungan Regresi
X Y XY X² 0,161 3,075 0,495 0,026 0,121 2,075 0,251 0,015 0,064 1,075 0,069 0,004 0,038 0,075 0,003 0,001 ∑ X =0,384 ∑ Y = 6,3 ∑ XY = 0,818 ∑ X² = 0,046 ̅ X = 0,096 ̅Y = 1,575 Diketahui n = 4 Maka : = 0,818 (0,384)(6,3) 4 0,046 (0,384)4 ² = 23,056 a = 1,575–(23,056) (0,096) = -0,638
Gambar 10. Kurva Standar PertumbuhanBacillus thuringiensdengan Persamaan linear ✌✍ ✎✏ ✑ ✒✍ ✎✏ ✑ ✓✍ ✎✏ ✑ ✎✍ ✎✏✑ y = 23,✎✑✔ - 0,638 R² = 0,982 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 0,05 0,1 0,15 0,2 Ju m la h s e l Absorbansi Series1 Linear (Series1)