KARAKTERISASI FISIOLOGI DAN PERTUMBUHAN Bacillus thuringiensis DARI TANAH NAUNGAN DI LINGKUNGAN UNIVERSITAS LAMPUNG

Oleh Melani Pakpahan

Skripsi

Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Memperoleh Gelar SARJANA SAINS

Pada Jurusan Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

Bacillus thuringiensisDARI TANAH NAUNGAN DI LINGKUNGAN UNIVERSITAS LAMPUNG

Oleh Melani Pakpahan

Bacillus thuringiensisadalah bakteri gram positif berbentuk batang, dan

pembentuk spora yang banyak ditemukan tersebar di tanah yang dikembangkan sebagai bioinsektisida. KeberadaanBacillus thuringiensisdipengaruhi kondisi lingkungan. Perbedaan kondisi lingkungan dapat mengakibatkan perbedaan sifat-sifat fisiologi mikroba. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui sifat-sifat fisiologi isolatBacillus thuringiensisyang berasal dari tanah naungan meliputi katalase, motilitas, pengaruh suhu dan pH terhadap pertumbuhan Bacillus thuringiensis.

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan April sampai Juni 2013 di Laboatorium Mikrobiologi Jurusan Biologi FMIPA Unila. Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah rancangan acak lengkap (RAL) tiga kali pengulangan. Parameter yang diamati yaitu enzim katalase dari masing-masing isolat, sifat motilitas isolat, pertumbuhan koloni isolat pada variasi pH dan suhu. Isolat yang diuji adalah isolatBtPBG2,BtPKP,BtPMH2,BtPBG1,BtPML,Bt PBR1,BtPMH1,BtPAKA,BtPBR2. Semua isolat menghasilkan enzim katalase, 8 isolat bersifat motil dan 1 isolatBtPMH1 tidak motil. IsolatBtPBG1,Bt PBR1, danBtPML menunjukkan karakterBacillus thuringiensisyaitu bersifat toksik terhadap ulat. Pertumbuhan optimumBtPBG1 terdapat pada suhu 30oC dan pH 7,5;BtPBR1 terdapat pada suhu 30oC dan pH >8;BtPML terdapat pada suhu 30oC dan pH 7,4.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... iii

DAFTAR GAMBAR ... iv

I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang... 1

B. Tujuan Penelitian ... 4

C. Manfaat Penelitian ... 4

D. Kerangka Pemikiran ... 4

E. Hipotesis ... 5

II. TINJAUAN PUSTAKA A. Bacillus thuringiensis... 6

1. Ciri-ciri MorfologiBacillus thuringiensis... 7

2. KlasifikasiBacillus thuringiensis... 8

3. FisiologiBacillus thuringiensis... 9

B. Karakterisasi Bakteri ... 12

C. Pengaruh Suhu ... 14

D. Pengaruh pH ... 16

III. METODE PENELITIAN A. Waktu dan Tempat Penelitian... 17

B. Alat dan Bahan ... 17

C. Metode Penelitian ... 18

D. Prosedur Kerja ... 18

1. Pengecatan Gram ... 18

2. Pengecatan Spora... 19

3. Uji Katalase ... 19

4. Uji Motilitas... 20

5. Uji Toksisitas ... 21

6. Perhitungan Sel Bakteri sdecara Langsung ... 21

7. Pengaruh pH ... 22

E. Tahapan Penelitian... 23

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Uji Katalase, Motilitas, dan Uji Toksisitas

Bacillus thuringiensis... 24 B. Pengaruh pH terhadap Pertumbuhan

Bacillus thuringiensis... 26 C. Pengaruh Suhu terhadap Pertumbuhan

Bacillus thuringiensis... 30

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan ... 34 B. Saran ... 34

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Bacillus thuringiensis merupakan salah satu bakteri patogen serangga yang telah dikembangkan menjadi salah satu bioinseksitisida yang patogenik

terhadap larva nyamuk dan larva lalat hitam. Namun tidak toksik terhadap

lingkungan dan organisme bukan sasaran (Carroziet al.,1991). Menurut Feitelson,et al.(1992), secara ekonomiBacillus thuringiensissangat banyak digunakan untuk produksi bioinsektisida dan telah digunakan secara luas untuk

mengendalikan larva hama serangga.

Bacillus thuringiensis adalah bakteri Gram positif berbentuk batang, dan pembentuk spora yang banyak ditemukan tersebar di tanah. Salah satu

karakteristikBacillus thuringiensisadalah dapat memproduksi toksin kristal protein di dalam sel yang bersama-sama dengan spora ketika mengalami

sporulasi. Dalam perkembangannya, protein yang bersifat toksin terhadap

serangga tersebut dinamakan sebagaiinsecticidal crystal protein(ICP) atau delta endotoksin (Gillet al., 1992). Kristal protein bersifat toksin pada serangga disebabkan adanya aktifitas proteolisis dalam sistem pencernaan

serangga. Toksin akan bereaksi dalam usus serangga sehingga menyebabkan

Hal ini mengganggu keseimbangan osmotik sel di dalam usus sehingga

serangga akan berhenti makan dan mati (Bahagiawati, 2002).

Bacillus thuringiensisdapat diisolasi dari berbagai habitat, antara lain dari tanah, serangga mati, dan daun pada beberapa jenis tanaman conifer.

Beberapa jenisBacillus thuringiensis jugadapat ditemukan pada berbagai jenis tanaman, termasuk sayuran, kapas, tembakau, dan tanaman hutan.

Namun yang lebih banyak ditemukan adalah di tanah. Menurut lay (1994),

bakteri tanah perlu dilakukan identifikasi yang didasarkan pada morfologi,

sifat biakan, dan sifat biokimia karena bakteri tidak memiliki ciri anatomi

yang nyata.

KeberadaanBacillus thuringiensisdalam tanah dipengaruhi beberapa faktor antara lain tipe tanah, kemampuan spora untuk germinasi dan kondisi geografi.

Tanah dengan kisaran pH 6,0 - 6,5 lebih baik untuk ketahanan spora

dibandingkan dengan pH 4,0 - 4,9 (Petras dan Casida, 1985). Kemampuan

spora untuk germinasi tidak dipengaruhi oleh pH tanah melainkan dipengaruhi

oleh kelembaban tanah.

Kondisi tanah pada setiap jenis-jenis pohon naungan berbeda-beda, dapat

dilihat dari struktur dan komponen penyusun tanah. Komponen dan struktur

tanah menentukan keberadaan oksigen dan air dalam tanah. Kondisi tersebut

dapat menyediakan makanan dan ruang hidup bagi mikroorganisme tanah

mikroorganisme di dalam tanah tidak terpisah dari ketersediaan bahan organik

dan mineral, keadaan iklim daerah, tanaman yang tumbuh, reaksi yang

berlangsung di dalam tanah dan kelembaban tanah (Sutedjo,et al.,1996).

Pohon naungan mampu tumbuh pada tanah kering maupun tanah yang lembab

dan memiliki jenis tegakan yang berbeda-beda. Pohon naungan pada kondisi

lingkungan yang berbeda memiliki ketersediaan unsur hara, kondisi faktor

biotik dan abiotik yang berbeda juga. Hal ini akan mempengaruhi aktifitas

dan jenis mikroorganisme yang ada dalam tanah naungan. Perbedaan kondisi

lingkungan dapat mengakibatkan perbedaan sifat morfologi dan sifat fisiologi

mikroba. PertumbuhanBacillus thuringiensisdipengaruhi oleh lingkungan, diantaranya suhu dan pH. Menurut Morriset al. (1996), suhu dan pH berpengaruh terhadap produksi spora dan kristal protein. Isolat yang

digunakan dalam penelitian ini adalah isolat yang berasal dari tanah naungan

yang berbeda yaitu naungan pohon Bungur, Kerai Payung, Mahoni, Melinjo,

Beringin, dan Akasia. Bentuk naungan dapat mempengaruhi karakter bakteri

seperti motilitas, ada tidaknya enzim katalase, dan pertumbuhan bakteri

terhadap pengaruh suhu dan pH lingkungan. IsolatBacillus thuringiensis yang berasal dari naungan di lingkungan Unila tersebut belum diketahui

B. Tujuan Penelitian

Mengetahui sifat-sifat fisiologi isolatBacillus thuringiensisyang berasal dari tanah naungan meliputi katalase, motilitas, pengaruh suhu dan pH terhadap

pertumbuhanBacillus thuringiensis.

C. Manfaat Penelitian

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai

karakter fisiologi dan pertumbuhanBacillus thuringiensispada jenis-jenis tanah naungan di lingkungan Universitas Lampung sebagai kontrol biologis

serangga yang dapat digunakan menjadi bioisektisida.

D. Kerangka Pemikiran

KeberadaanBacillus thuringiensisdalam tanah dipengaruhi oleh faktor lingkungan antara lain pH dan suhu. Mikroorganisme memiliki suhu

minimum dan suhu maksimum yang berbeda-beda untuk pertumbuhannya.

Suhu pertumbuhan untukBacillus thuringiensisberkisaran antara 15oC–40oC. Bacillus thuringiensisdapat tumbuh pada medium yang memiliki pH pada kisaran 5.5 - 8.5 dan tumbuh optimum pada pH 6.5 - 7.5

(Bernhard dan R. Utz, 1993).

Naungan pohon berpengaruh terhadap faktor biotik dan abiotik yang dapat

mengakibatkan perbedaan sifat fisiologi mikroba. Universitas Lampung

memiliki banyak jenis pohon naungan, beberapa diantaranya ditemukan isolat

Akasia, Mahoni, Kerai Payung dan Beringin. Naungan tersebut memiliki

kondisi lingkungan berbeda yang berpengaruh terhadap struktur dan

komponen penyusun tanah. Hal ini dipengaruhi oleh jenis serasah dan tingkat

pencahayaan pada naungan tersebut berbeda-beda. Senyawa organik yang

terkandung dalam serasah seperti kandungan lignin, selulosa dan karbohidrat

dapat mempengaruhi kemampuan suatu mikroba mendekomposisi serasah.

Kandungan senyawa organik pada serasah menentukan keasamaan lingkungan

tanah di bawah naungan. Naungan juga berpengaruh terhadap intensitas

cahaya. Naungan dengan kanopi yang luas dapat mengurangi penguapan pada

tanah sehingga kondisi lingkungan lebih lembab, sedangkan naungan dengan

kanopi yang sempit, pencahayaan dapat terpapar langsung ke tanah dan

meningkatkan penguapan sehingga kondisi tanah lebih kering. Hal ini akan

menentukan suhu suatu lingkungan pada naungan. Suhu dan keasaman tanah

akan mempengaruhi pertumbuhan bakteri.

E. Hipotesis

Hipotesis yang diajukan pada penelitian ini adalah terdapat perbedaan karakter

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensismerupakan salah satu bakteri patogen bagi serangga. Bakteri ini bersifat gram positif, berbentuk batang, memilki flagella,

membentuk spora secara aerob dan selama sporulasi membentuk kristal

protein paraspora yang dapat berfungsi sebagai insektisida. Kristal protein ini

dikenal dengan nama N-endotoksin (Shieh, 1994 ; Knowles, 1994). Menurut

Gillet al. (1992) spora yang dihasilkan olehBacillus thuringiensisberbentuk oval dan berwarna terang, rata-rata memiliki dimensi 1,0 - 1,3 µm. Jika

ditumbuhkan pada medium padat, koloniBacillus thuringiensisberbentuk bulat dengan tepian berkerut, memiliki diameter 5-10 mm, berwarna putih,

elevasi timbul pada permukaan koloni kasar (Bucher, 1981).

Bacillus thuringiensispertama kali ditemukan di Jepang pada tahun 1901 dari penyakit pada jentik ulat sutera (Swadener, 1994). Ishiwata adalah orang

yang pertama kali mengisolasikanBacillus thuringiensisdari larva ulat sutera yang mati (Dulmageet al., 1990). Pada saat itu, belum dikenal sebagai Bacillus thuringiensis. Tahun 1911, Berliner menemukan sejenis bakteri yang sama dengan yang ditemukan oleh Ishiwata dari kumbang tepung

(Swadener, 1994; Dulmageet al., 1990). Bakteri ini kemudian dinamakan denganBacillus thuringiensis.

1. Ciri-ciri MorfologiBacillus thuringiesis

Bacillus thuringiensismerupakan salah satu anggotaB. cereusgrup bersama denganB. anthraxis. B. thuringiensismempunyai ciri khusus yaitu

kemampuannya untuk menghasilkan protein kristal protoksin intraseluler

dari kelompok -endotoksin sehingga dapat dibedakan denganB. Cereus. Endospora berbentuk oval hingga silindris, terletak parasentral atau terminal.

Bakteri tersebut dapat nonmotil atau motil dengan adanya flagela tipe

peritrik (Bravo, 1997).

Pewarnaan Gram dan spora dapat dilakukan dalam uji sifat sitologi suatu

bakteri. Prinsip pewarnaan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap

zat warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri

Gram positif terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat Kristal

violet lebih kuat, sedangkan sel Gram negatif mengandung lebih banyak

lipid sehingga pori-pori mudah membesar dan Kristal violet mudah larut saat

pencucian alkohol (Pelczar and Chan, 2008).

Bacillus thuringiensismerupakan bakteri Gram positif. Menurut Klien, et al.(2007) bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang mengandung peptidoglikan dan juga asam teikoat dan asam teikuronat. Oleh sebab itu

beberapa bakteri, asam teikoat merupakan antigen permukaan (antigen

dinding sel) dan ada yang merupakan selaput pada selnya. Asam teikoat ini

pada umumnya terdiri dari gula netral seperti galaktosa, manosa, ramnosa,

arabinosa dan glukosamin. Lapisan yang demikian itu akan menyelimuti

seluruh sel bakteri sehingga menyerupai selubung yang kuat dan dinamakan

murein.

2. KlasifikasiBacillus thuringiensis Klasifikasi menurut Tarumingkeng (2001) :

Kingdom : Eubacteria

Division : Bakteria

Class : Schizomycetes

Ordo : Eubacteriales

Family : Bacillaceae

Genus :Bacillus

[image:14.595.134.361.524.684.2]

Spesies :Bacillus thuringiensis

Sedikitnya terdapat 34 subspesies dariBacillus thuringiensis yang disebut serotype atau varietas dariBacillus thuringiensisdan lebih dari 800 keturunan atau benihBacillus thuringiensistelah diisolasi (Swadener, 1994). Pada beberapa subspesies dari bakteriBacillus thuringiensisyaitu kurstaki, aizawai, sotto entomocidus, berliner, san diego, tenebroid, morrisoni dan

israelensis, dijumpai beberapa jenis strain, seperti HD-1, HD-5 dan

sebagainya dalam satu subspesies (Bahagiawati, 2002).

3. FisiologiBacillus thuringiensis

Ciri khas yang terdapat padaBacillus thuringiesisadalah kemampuannya membentuk kristal (tubuh paraspora) bersamaan dengan pembentukan spora,

yaitu pada waktu sel mengalami sporulasi. Kristal proteinBacillus thuringiensismempunyai beberapa bentuk, diantaranya bentuk bulat pada subsp.israelensisyang toksik terhadapDiptera, bentuk kubus yang toksik terhadapDipteratertentu danLepidoptera, bentuk pipih empat persegi panjang (flat rectangular) pada subsp.tenebriosisyang toksik terhadap Coleoptera, bentuk piramida pada subsp.kurstakiyang toksik terhadap Lepidoptera(Shieh 1994), sedangkan menurut Trizelia (2001), kristal protein memiliki beberapa bentuk bedasarkan adanya hubungan nyata antara bentuk

kristal dengan kisaran daya bunuhnya. Varietas yang memiliki daya bunuh

terhadap serangga ordoLepidopteramemiliki kristal protein yang berbentuk bipiramida dan jumlahnya hanya satu tiap sel, sedangkan yang berbentuk

kubus, oval, dan amorf umumnya bersifat toksik terhadap serangga ordo

daya bunuh terhadap serangga ordoColeopteraberbentuk empat persegi panjang dan datar batu pipih.

SporaBacillus thuringiensismerupakan suatu usaha perlindungan diri dari pengaruh lingkungan luar yang buruk, hal ini terjadi karena dinding bakteri

yang bersifat impermeabel. Pembentukan spora juga bersamaan dengan

terbentuknya kristal protein yaitu ketika sel mengalami lisis sesuda sporulasi

sempurna (Zeigler, 1999).

Kristal protein yang bersifat insektisida ini sebenarnya hanya protoksin yang

jika larut dalam usus serangga akan berubah menjadi polipeptida yang lebih

pendek (27-147 kDa). Pada umumnya, kristal protein di alam bersifat

protoksin karena adanya aktivitas proteolisis dalam sistem pencernaan

serangga yang mengubahBacillus thuringiensisprotoksin menjadi

polipeptida yang lebih pendek dan bersifat toksin. Toksin yang telah aktif

berinteraksi dengan sel-sel epitelium di usus tengah serangga sehingga

menyebabkan terbentuknya pori-pori di sel membran saluran pencernaan

serangga (Bahagiawati, 2002).

Efektifitas dari toksin tertentu juga dipengaruhi oleh kelarutan, afinitas

tehadap reseptor yang ada serta pemecahan proteolitik ke dalam toksin.

Secara umum dapat disimpulkan bahwa cara kerja kristal protein sebagai

(Milneet al. 1990). Faktor lain seperti umur dari serangga juga merupakan salah satu faktor yang menentukan toksisitas dariBacillus thuringiensisjentik serangga yang lebih muda lebih rentan jika dibandingkan dengan jentik yang

lebih tua (Swadener 1994).

Gen yang mengkode kristal protein yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus thuringiensistelah diisolasi dan dikarakterisasi, dikenal dengan sebutan gen Cryyang berasal dari kata Crystal (Bahagiawati, 2002). GenCryadalah paraspora yang mengandung kristal protein dariBacillus thuringiensisyang menghasilkan toksik terhadap organisme sasaran. GenCytadalah paraspora yang mengandung kristal protein dariBacillus thuringiensis yang

menghasilkan aktivitas hemolitik atau sitolitik.

Gen Cry dapat dikelompokkan menjadi 4 kelas yaitu Cry I, Cry II, Cry III

dan Cry IV dilihat dari kesamaan struktur asam amino dan aktifitas

insektisidanya. Masing-masing jenis gen tersebut dapat menentukan sifat

toksik kristal protein yang spesifik terhadap larva. Tipe patogenesis dari ke

4 jenis gen Cry yang mengkode kristal protein dapat dikelompokkan seperti

[image:18.595.130.516.106.420.2]

Tabel 1.Tipe patogenitas dariBacillus thuringiensis

Tipe patogenitas Contoh Jenis Gen Contoh Produk Spesifik untuk ordo

Lepidoptera Contoh:  Moth  Kupu-kupu Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki

CryI  Dipel (Abbott)

 Bactospeine (Philip Duphar)

 Thuricide, Javelin (Sandoz)

Spesifik untuk ordo Diptera

Contoh:

 Two winged flies

 Midges

 Crane flies

 Lalat rumah  Nyamuk

Bacillus thuringiensis

subsp.

Israelensis

CryIII  Vectobac (Abbott)

 Bactimos (Philip Duphar)

 Teknar (Sandoz)

Spesifik untuk ordo Coleoptera

Contoh:

 Kumbang

Bacillus Thuringiensis

subsp.san diego

CryIV _ Trident (Sandoz)

 M-One (Mycogen)

Spesifik untuk ordo Lepidoptera dan Diptera

Bacillus thuringiensis

subsp.Aizawai

CryII Certan (Sandoz)

Sumber: Ellaret al., 2000

Mekanisme daya kerja dari endotoksin pada masing-masing gen Cry penting

untuk diketahui sebagai penentuan proses kunci yang bertanggung jawab

terhadap kespesifikan dari sebuah kristal protein. Faktor utama yang

menentukan kerja kristal protein adalah perbedaan pada larva yang

mempengaruhi proses kelarutan, proses kristal dari yang tidak aktif menjadi

aktif, dan keberadaan dari spesifik protoksin di dalam usus dari

spesies-spesies serangga (Bahagiawati, 2002).

B. Karakterisasi Bakteri

Karakterisasi bakteri berdasarkan morfologi, sifat biakan dan sifat biokimia

sangat diperlukan karena mikroba tidak memiliki ciri anatomi yang nyata.

tidak cukup untuk mengetahui ciri/jenis suatu mikroba. Ciri lain yang dapat

membantu dalam karakterisasi mikroba adalah pola pertumbuhan, reaksi

pertumbuhan pada karbohidrat dan penggunaan asam amino ( Lay, 1994).

Uji sifat morfologi bakteri sangat penting dilakukan terhadap bakteri maupun

kapang pada medium padat, berdasarkan sifat-sifat koloni seperti bentuk,

ukuran, warna, sensitifitas dan spesifitas (Prabaningtyas, 2003).

Katalase dan motilitas juga merupakan salah satu sifat biakan yang dapat

digunakan untuk mengkarakterisasi biakan tersebut. Uji katalase berguna

dalam mengidentifikasi kelompok bakteri yang dapat menghasilkan enzim

katalase. Dilakukan dengan cara : di atas kaca objek ditetesi satu tetes H2O2 3%, ditambahkan koloni bakteri dan langsung diamati terjadinya penguraian

hidrogen peroksida. Dinyatakan positif bila menghasilkan enzim katalase

yang ditandai dengan terbentuknya gelembung udara dan negatif bila tidak

ada gelembung udara. Terbentuknya gelembung disebabkan karena bakteri

yang ditambahkan hidrogen peroksida tersebut menghasilkan peroksida. Uji

motilitas berperan dalam mengetahui pergerakan bakteri. Bakteri yang

dinyatakan positif motil atau bergerak akan ditunjukan dengan adanya

kekeruhan pada media uji yang menunjukan pertumbuhan koloni (Aksoy dan

Ozman-Sullivan, 2008).

Reaksi positif uji katalase ditunjukkan dengan membentuk

pemecahan H2O2oleh enzim katalase yang diproduksi oleh bakteri tersebut. Bakteri yang termasuk bakteri katalase negatif tidak membentuk gelembung

udara yang berarti tidak terbentuk gas (Suryani, 2010).

Salah satu karakteristik danBacillus thuringiensisadalah dapat

memproduksi kristal protein dalam sel selama fase sporulasi Kristal toksin

memegang peranan penting karena aktivitasnya sebagai insektisida. Untuk

menumbuhkan dan memperbanyak kristal dan sporaBacillus thuringiensis telah digunakan berbagai media kimia seperti agar nutrien, media NYSMA,

NYPC dan Tryptose Phosphate Broth. Beberapa peneliti tidak menggunakan

media kimiawi untuk menumbuhkanBacillus thuringiensis, melainkan menggunakan media alami seperti berbagai media kelapa (air dan

endospermnya). Media kelapa relatif murah, dapat diperoleh setiap saat dan

terdapat di mana-mana, sedangkan media kimia harganya mahal dan tidak

mudah diperoleh. Air kelapa dan endosperm kelapa (santan) kaya akan asam

amino, gula dan garam serta merupakan media yang cocok untuk

pertumbuhanBacillus Thuringiensis(Sriganti, 2000).

C. Pengaruh Suhu

Tinggi rendahnya suhu lingkungan sangat penting bagi organisme karena

tidak semua tingkatan suhu cocok bagi pertumbuhan dan reproduksi

organisme. Secara umum terdapat 4 kelompok mikroorganisme berdasarkan

suhu lingkungan tempat hidupnya yaitu psikrofil, mesofil, termofil,

[image:21.595.139.534.87.250.2]

Gambar 2. Hubungan Suhu dan Pertumbuhan pada Kelompok

Mikroorganisme dengan Temperatur yang Berbeda (Madigan, et al.,2009: 159).

Setiap jenis bakteri memiliki suhu minimum dan suhu maksimum yang

berbeda-beda untuk pertumbuhan. Pada suhu minimum dan suhu lebih

tinggi dari maksimum akan memperlambat pertumbuhan bakteri. Hal ini

dapat dilihat dari pengaruh suhu terhadap enzim, makin tinggi suhu maka

aktifitas enzim juga makin cepat. Suhu yang terlalu tinggi akan

mendenaturasi enzim sehingga sel bakteri akan mengalami fase kematian.

Menurut Hidayat (2006), mikroba dapat dibedakan menjadi tiga golongan

berdasarkan suhu pertumbuhannya:

1. Mikroba psikrofil, dapat tumbuh pada suhu antara 0oC sampai 30oC, dengan suhu optimum 15oC. Kebanyakan tumbuh di tempat-tempat dingin, baik di daratan ataupun di lautan.

3. Mikroba termofil, dengan suhu pertumbuhan antara 40o-75oC dengan suhu optimum 55o-60oC. Pertumbuhan antara 40o-75oC dengan suhu optimum 55o-60oC. Pada jasad termofil dikenal pula stenotermofil (termofil obligat), yaitu mikroba yang dapat tumbuh baik pada suhu

60oC dan tidak dapat tumbuh pada suhu 30oC dan euritermofil (termofil fakultatif) yaitu yang mampu tumbuh di bawah 30oC.

D. Pengaruh pH

Pengaturan nilai pH medium merupakan salah satu faktor penting yang

mempengaruhi pertumbuhan dan pembentukan produk (Ketaren, 1990).

Besarnya pH untuk kecepatan pertumbuhan maksimum seringkali berkisar

antara satu sampai satu setengah unit. Sewaktu pertumbuhan

mikroorganisme, seringkali terjadi perubahan pH media, sebaliknya ketika

metabolisme protein dan asam amino dilepas, ion ammonium menyebabkan

pH menjadi basa. Bila terjadi penyimpangan pH, pertumbuhan dan

metabolisme mikroorganisme tanah dapat terhenti (Lay, 1994).

Bacillus thuringiensisdapat tumbuh pada medium yang memiliki pH pada kisaran 5.5 - 8.5 dan tumbuh optimum pada pH 6.5 - 7.5 (Benhard dan Utz,

1993). Bakteri ini dapat ditemukan di beberapa habitat seperti tanah,

pepohonan, pakan ternak, dan serangga mati. Spora berbentuk oval dan

berwarna hijau kebiruan, berukuran 1,0–1,3 µm dengan posisi terminal,

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan dari Bulan April sampai dengan Juni 2013, di

Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan

Alam, Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah kompor listrik, gelas

ukur, erlenmeyer,beaker glass, cawan petri, tabung reaksi, rak tabung reaksi, mikropipet, mikrotip, jarum ose, kapas, kertas kopi, tisu, aluminium

foil, pH meter, spektro,laminar air flow,inkubator bakteri, oven, vortex mixer dan alat-alat pendukung lainnya.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah Nutrient Agar

Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Universitas Lampung, alkohol 70%,

spritus, cat Gram A, B, C, dan D. Larutan catmalachite green, dan minyak imersi.

C. Metode Penelitian

Sifat fisiologi isolatBacillus thuringiensisdiperoleh dengan melakukan uji toksisitas, uji katalase, uji motilitas, uji pengaruh pH dan suhu terhadap

pertumbuhan bakteri. Hasil uji toksisitas, uji katalase, dan uji motilitas

disajikan dalam bentuk data deskriptif. Uji pengaruh pH dan suhu terhadap

pertumbuhan bakteri menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) 3

ulangan. Variasi pH yang akan diuji adalah pH 4, 5, 6, 7, dan 8 dan variasi

suhu yang diuji adalah suhu 20oC, 30oC, 40oC, 50oC, dan 60oC. Data yang diperoleh adalah jumlah sel bakteri berdasarkan absorbansi yang diukur

dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Data yang

diperoleh dilakukan analisis ragam. Perlakuan yang terdapat perbedaan nyata

pada taraf_{= 5%, dilanjutkan dengan menggunakan analisis polinomial}

orthogonal.

D. Prosedur Kerja 1. Pengecatan Gram

Pengecatan gram dilakukan dengan cara mengambil satu ose dari

masing-masing isolat bakteri tanah naungan,lalu diletakkan pada gelas preparat, diratakan, lalu difiksasi sebentar di atas api bunsen (± 5 detik). Setelah itu

menit, lalu dibilas dengan akuades, kemudian ditetesi kembali dengan

larutan Gram B 3 tetes dan didiamkan selama 1 menit, lalu dibilas.

Setelah itu diteteskan larutan Gram C 3 tetes, diamkan selama 30 detik,

lalu dibilas dengan akudes. Lalu diteteskan dengan larutan Gram D 3

tetes, diamkan selama 2 menit, setelah itu dibilas dengan akuades dan

dikeringanginkan. Dikatakan Gram positif jika hasil pengecatan berwarna

ungu, dan Gram negatif jika berwarna merah.

2. Pengecatan Spora

Pengecatan spora dilakukan dengan cara mengambil satu ose dari

masing-masing isolat bakteri tanah naungan,lalu diletakkan pada gelas preparat, diratakan, lalu difiksasi dengan melewatkannya di atas bunsen sebanyak

10 kali. Kemudian preparat tersebut ditetesi catmalachite greendan didiamkan selama 10 menit, setelah itu dibilas dengan aquades dan

dikeringanginkan. Membedakan endospora dan sel vegetatif, diberikan cat

penutup yaitu larutansafraninselama 5 detik kemudian dibilas dengan aquades dan dikeringanginkan. Hasil pengecatan ini akan menunjukkan

spora tampak berwarna hijau, sedangkan sel vegetatifnya berwarna merah.

3. Uji Katalase

Uji katalase dilakukan dengan mengambil satu mata jarum ose koloni

bakteri dari stok kultur, kemudian dioleskan pada gelas objek. H2O2 diteteskan pada preparat bakteri tersebut kemudian diamati keberadaan

Contoh tahapan uji katalase dapat dilihat pada Gambar 3a. Uji katalase

dikatakan positif bila terjadi gelembung udara (O2), sedangkan dikatakan negatif bila tidak terjadi gelembung udara (Gambar 3b).

(a) (b)

Gambar 3. (a) Tahapan Uji Katalase, (b) Contoh Hasil Uji Katalase Sumber: Pradhika (2010)

4. Uji Motilitas

Uji motilitas dilakukan dengan mengambil satu ose masing-masing isolat

bakteri tanah naungan dengan ose runcing, lalu ditusukkan secara lurus

atau vertikal pada media NA padat yang telah disiapkan pada tabung

reaksi, kemudian diinkubasi 2 hari dalam inkubator. Dikatakan motil jika pertumbuhan koloni bakteri menyebar, sedangkan non-motil jika

[image:26.595.172.499.214.385.2]

5. Uji Toksisitas

Uji toksisitas dilakukan dengan menggunakan ulat (larva Lepidoptera).

Ulat tersebut dimasukkan dalam wadah dan diberikan makanan berupa

daun yang telah dioleskan dengan isolatBt. Wadah tersebut ditutup menggunakan plastik dan dilubangi secukupnya untuk saluran udara. Uji

toksisitas ini dilakukan selama 72 jam.

6. Perhitungan Sel Bakteri secara Langsung (Mikroskopis)

Perhitungan sel bakteri secara mikroskopis dilakukan dengan membuat

pengenceran. Pengenceran pertama (10-1) diperoleh dengan mengambil 1 ml suspensi bakteri kemudian ditambahkan ke dalam 9 ml aquades dan

dihomogenkan mengunakan vortek selama 1-2 menit. 1 ml dari

pengenceran pertama ditambahkan ke dalam 9 ml aquades berikutnya

sehingga diperoleh pengenceran 10-2, kemudian dari pengenceran 10-2 diambil 0,01 ml suspensi bakteri dan diletakkan pada gelas objek yang

berukuran 1 cm X 1 cm dan dilakukan pengecatan gram. Perhitungan

kepadatan sel bakteri secara langsung dilakukan dengan melihat jumlah sel

pada luas lapang pandang mikroskop. Penentuan luas lapang pandang

mikroskop dilakukan dengan mengukur diameter areal pandang mikroskop

menggunakan mikrometer objektif yang mempunyai skala terkecil 0,01

mm. Nilai diameter areal pandang mikroskop digunakan untuk

Luas areal pandang mikroskop =

Dimana r= jari-jari areal pandang mikroskop

Sedangkan rumus penentuan perhitungan kepadatan sel bakteri secara

langsung yaitu sebagai berikut:

Konsentrasi Sel =

( ) ( )

7. Pengaruh pH

Uji pengaruh pH terhadap isolatBacillus thuringiensis(kuantitatif) dilakukan dengan menggunakan media cair Nutrient Broth (NB) yang

diatur pada pH dengan perlakuan pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8.

Masing-masing perlakuan diinokulasi kultur isolatBacillus thuringiensis/ bakteri uji sebanyak 106CFU/ml. Sebagai kontrol adalah media NB cair tanpa penambahan bakteri. Kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam suhu

37oC. Pertumbuhan sel ditentukan berdasarkan absorbansi menggunakan spektrofotometer UV-vis pada panjang gelombang 620 nm.

8. Pengaruh Suhu

Uji pengaruh suhu terhadap pertumbuhan isolatBacillus thuringiensis (kuantitatif) dilakukan menggunakan media cair yaitu Nutrient Broth (NB)

yang disterilisasikan dengan ketetapan pH optimum pertumbuhan,

berdasarkan abso

panjang gelom

[image:29.595.72.525.182.725.2]

E. Tahapan Peneliti

Gambar 4. Diagram A Identifika

Isola

Uji Katalase

Uji Toksisitas

Spektrofotometer =

Pengar pH 7, da

Pengar 50oC, da Uji Motilitas

absoransi menggunakan spektrofotometer

UV-ombang 620 nm.

litian

Alir Tahapan penelitian

Penge Gram Pen Spo P Kr

ifikasiBacillus thuringiensis

solatBacillus thuringiensis

Spektrofotometer =

Pembuatan Kurva Standar

aruh pH ( pH 4, pH 5, pH 6, 7, dan pH 8)

aruh suhu (20oC, 30oC, 40oC, , dan 60oC)

V-vis pada gecatan m engecatan pora Pengecatan Kristal Protein

Spektrofotometer =

I. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Kesimpulan dari hasil penelitian yang telah dilakukan adalah sebagai berikut:

1. Berdasarkan identifikasi terhadap 9 isolat bakteri tanah terdapat 3 isolat

yaitu isolatBtPBG1,BtPBR1, danBtPML yang menunjukkan karakter Bacillus thuringiensis yaitu bersifat toksik terhadap ulat, menghasilkan enzim katalase dan bersifat motil.

2. IsolatBtPBG1,BtPBR1, danBtPML merupakan golongan bakteri mesofilik dengan pertumbuhan sel optimum terletak antara suhu 30oC dan 40oC.

3. IsolatBtPBG1,BtPBR1, danBtPML tumbuh dengan baik pada pH basa yaitu dengan perkiraan pH 7,5 pada isolatBtPBG1, pH >8 pada isolatBt PBR1, dan pH 7,4 pada isolatBtPML.

B. Saran

Berdasarkan hasil penelitian uji toksisitas, uji katalase, uji motilitas,

karakteristik fisiologi dengan melihat bentuk-bentuk kristal protein untuk

DAFTAR PUSTAKA

Abdurachman, A., K. Nugroho, dan S. Karama. 1998. Optimalisasi pemanfaatan sumber daya lahan untuk mendukung program Gema Palagung 2001.

Prosiding Seminar Nasional dan Pertemuan Tahunan Komda HITI 1998.

Buku 1. hlm. 1-11.

Ahdianto D. F. 2006. Kajian Pengaruh ph dan Suhu Terhadap Produksi

Bioinsektisida oleh Bacillus thuringiensis subsp.israelensis Menggunakan Substrat Onggok Tapioka.SkripsiFakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Bahagiawati. 2002. PenggunaanBacillus thuringiensis sebagai Bioinsektisida. Buletin Agrobio 5(1): 21-28. Bogor.

Benson, H. J. 2002.Microbiology Applications Laboratory Manual in General Microbiological,. Mc Graw Hill Companies, New York.

Bernhard K., R. Utz. 1993. Production ofBacillus thuringiensis Insecticides for Experimental and Commeercial Uses. Di dalam P. F. Entwilse, J. S. Cory, M. J. Bailey dan S. Higgs (Penyunting).Bacillus thuringiensis an Enviromental Biopesticide theory and Practice.John Wiley and Sons, Chichester.Hlm. 255-265.

Buchner, G. E. 1981.Identification of Bacteria Found in Insect. Di dalam H. D. Gurges (editor). Microbial Control Pest and Plant Disease 1970-1980. Academic Press, New York.

Carozzi, N.B., V.C. Kramer, G.W. Warren, S. Evola, and M.G. Koziel. 1991. Prediction of insecticidal activity ofBacillus thuringiensisstrains by polymerase chain reaction product profiles.Appl. Environ. Microbiol. 57: 3057–3061.

Deacon J . W. 1983.Microbial Control of Plant and Diseases. Van Nostrand Reinhold (VK) Co, Ltd.

Dulmage, H. T., J. A. Corea dan G. G. Morales. 1990. Potential for Improved Formulation of Bacillus thuringiensis israelensis through Standarization and Fermentation Development. Dalam H. de Barjac dan D. J.

Surtherland (editor).Bacterial Control of Mosquitos and Blackfleis : Biochemistry, Genetic and Application of Bacillus thuringiensis israelensis & Bacillus sphaericus. Rotgers University Press. New Brunswick, New Jersey, USA : 110-133.

Ellar, D.J. dan B. Promdonkoy. 2000. Membrane Pore Architecture of A Cytolitycoxin fromBacillus thuringiensis.Biochemical Journal. 350, 275-282.

Feitelson, J. S., Payne, L. Kim. 1992.Bacillus thuringiensis: Insects and Beyond. Biotechnology. 10 : 271–275. Dalam Bahagiawati (2002). Penggunaan Bacillus thuringiensissebagai Bioinsektisida.Bulletin Agrobio5 (1) : 21-28.

Gill, S. S., E. A. Cowles dan P. V. Pietrantonio. 1992.The Mode of Action of Bacillus thuringiensis. Endotoxin. Annu, Rev. Entomol. 37 : 615-636. Gumbira-Sa’id, E. 1987.Bioindustri. Mediyatama Sarana Perkasa, Jakarta. Hidayat, Nur. 2006.Mikrobiologi Industri.Andi Yogyakarta. Yogyakarta. Ketaren, S. 1990.Kinetika Reaksi Biokimia. Departemen Pendidikan dan

Kebudayaan. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi PAU Bioteknologi. IPB, Bogor.

Klein E, DL.Smith, Laxminarayan. 2007. Hospitalizations and Deaths Caused by Methicillin Resistant Staphylococcus aureus, United States, 1999–2005. Emerg Infect Dis13 (12): 1840–6.

Lay, B. W. and Hastowo. 1992.Mikrobiologi.Rajawali Press. Jakarta. Lay, B. W. 1994.Analisis Mikroba di Laboratorium. Raja Grafindo Persada.

Jakarta.

Madigan, T.M., J.M. Martinko, P.V. Dunlap, and D.P. Clark. 2009.Biology of Microorganisms. Ed ke 12. Pearson Benyamin Cummings. San Fransisco. Hlm: 149, 390, 624.

Nurwijayanti, R. 2005. Daya Bunuh Bacillus thuringiensis Isolat Bangkalan Madura terhadap Berbagai Instar Larva Nyamuk.SkripsiJurusan Biologi Fakultas MIPA Universitas Brawijaya. Malang.

Pelczar, M. J. and Chan E. C. S. 2008.Dasar-dasar Mikrobiologi. Jilid 1. Hadioetomo (penerjemah), Terjemahan dari:Elements of Microbiology. UI press. Jakarta.

Petras, S. F. and L. E. Casida. 1985. Survival of Bacillus thuringiensis spores in soil.Appl. Environ. Microbiol.50: 1496-1501.

Shieh, T. R. 1994. Identification and Clasification of Bacillus thuringiensis. DalamKumpulan Makalah Seminar Bacillus thuringiensis. Komisi Pestisida, Departemen Pertanian. Jakarta.

Sriganti E.2000. ToksisitasBacillus thuringiensis subspberlinerdansubs aizaway Terhadap LarvaCrocodoloma binotalis zell(Lepidoptera: Pyralidae) dan Spodopteralitura(Lepidopotera;Noctuidae).SkripsiFakultas MIPA Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Suryani, Y. Astuti, B. Oktavia, dan S. Umniyati. 2010.Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat dari Limbah Kotoran Ayam Sebagai Agensi

Probiotik dan Enzim Kolesterol Reduktase.Prosiding Seminar Nasional Biologi. 138-147

Sutedjo, M. M., A. G. Kartasapoetra, R. D. S. Sastroadmodjo. 1996.Mikrobiologi Tanah. Penerbit Rinekha Cipta, Jakarta.

Swadener, C. 1994. Bacillus thuringiensis. Journal of Pesticides Reform vol. 14, No 3: 13-20. Northwest Coalition for Alternative to Pesticides.Ottawa. Taruminkeng, Rudy C. 2001.Makalah Falsafah Sains (Pps 702). Program

Pascasarjana/S3. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

Trizelia. 2001.Makalah Falsafah Sains(PPs 702). Program Pascasarjana/SC. Institut Pertanian Bogor. Bogor.

[image:35.595.118.385.140.214.2]

Lampiran 1.Hasil Uji Absorbansi Pertumbuhan Sel Standar Tabel 5. Data hubungan jumlah sel dengan absorbansi 620nm

Absorbansi Jumlah sel

0,161 3,075

0,121 2,075

0,064 1,075

0,038 0,075

Persamaan regresi menggunakan metode Least Square

Y = a + bx

Y = jumlah sel

X = nilai absorbansi pada panjang gelombang 620 nm

=

( )( )

( ) ( )²

a =Y̅-bX̅

Tabel 6. Perhitungan Regresi

X Y XY X²

0,161 3,075 0,495 0,026

0,121 2,075 0,251 0,015

0,064 1,075 0,069 0,004

0,038 0,075 0,003 0,001

∑ X =0,384 ∑ Y = 6,3 ∑ XY = 0,818 ∑ X² = 0,046

̅

X = 0,096 ̅Y = 1,575 Diketahui n = 4

Maka :

= 0,818

(0,384)(6,3) 4

0,046 (0,384)₄ ²

= 23,056

[image:35.595.104.527.267.759.2]

[image:36.595.111.477.95.315.2]

Gambar 10. Kurva Standar PertumbuhanBacillus thuringiensdengan Persamaan linear

✌✍ ✎✏ ✑

✒✍ ✎✏ ✑

✓✍ ✎✏ ✑

✎✍ ✎✏✑

y = 23,✎✑✔ - 0,638 R² = 0,982

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

0 0,05 0,1 0,15 0,2

Ju

m

la

h

s

e

l

Absorbansi

Series1