BAB III METODOLOGI PENELITIAN
3.3. Prosedur Kerja
(MSS), Minimalt Salt Sugar Agar (MSSA), agar bakto, larutan fisiologis (NaCl 0.85%), sukrosa 0,1 %, yeast ekstrak, Flourescein Diacetate (FDA), aseton (pa), KH2PO4 (pa), alumunium foil, aquadest, alkohol 70%, benzen, heksana, dietil eter, serbuk KBr kering.
Tabel 6. Komposisi Medium
Nama medium Agar (g) MS (ml) Ekstrak Ragi (g) Sukrosa (g) Serbuk Batubara (g) Keterangan MSSA 1,5 200 0,2 1 2 Peremajaan Kultur Spora MSS - 600 0,6 g 0,6 g 1,5 g @ 30 ml Biosolubilisasi 3.3. Prosedur Kerja
3.3.1. Persiapan dan Sterilisasi Alat
Alat – alat gelas yang akan digunakan dibersihkan terlebih dahulu. Alat-alat yang telah dibersihkan, disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit. Peralatan yang tidak tahan panas disterilkan dengan menggunakan alkohol 70% (Waluyo, 2008).
3.3.2. Persiapan Serbuk Batubara
Batubara digerus dengan mortal secara aseptik di dalam LAFC hingga berukuran kecil. Batubara yang telah digerus, disaring menggunakan penyaring dengan ukuran 100 mesh dan diayak sampai halus. Sampel batubara yang sudah halus disterilisasi menggunakan autoklaf (Selvi dan Banerje, 1982).
36 3.3.3. Pembuatan Medium Minimal Salt (MS)
Medium MSS dibuat dengan cara menimbang sebanyak 0,52 g MgSO4.7H2O ; 0,003 g ZnSO4.7H2O ; 5 g KH2PO4 ; 0,005 g FeSO4, dan 1 g NH4(SO4). Bahan-bahan tersebut dilarutkan dengan 1 liter aquades. Campuran tersebut dilarutkan sampai homogen (Silva et al, 2007).
3.3.4. Pembuatan Medium Minimal Salt + Sugar + Agar (MSSA)
Medium MSSA dibuat dengan sebanyak 100 ml MS, ditambahkan batubara 1 % (2 g) dan dimasukan ke dalam Erlenmeyer 1, ditutup dengan
alumunium foil, kemudian 100 ml aquadest dimasukan ke dalam Erlenmeyer 2 yang berbeda lalu ditambahkan 1,5 g agar, 1 g sukrosa, dan 0,2 g ekstrak ragi setelah itu dipanaskan dan ditutup dengan alumunium foil. Kedua Erlenmeyer diautoklaf dengan tekanan 1 atm, suhu 121oC selama 15 menit. Kedua larutan yang berada di Erlenmeyer berbeda tersebut dicampur, dihomogenkan, dan dituang ke dalam cawan petri yang telah diautoklaf.
3.3.5. Peremajaan Kultur Spora Kapang
Empat jenis Kultur kapang hasil isolasi dari tanah pertambangan diambil menggunakan ose steril, kemudian diinokulasi ke dalam 4 cawan petri yang berisi 15 ml medium MSSA. Medium MSSA direkatkan menggunakan parafilm dan diberi label sesuai kode isolatnya. Cawan petri yang berisi kultur kapang tersebut diinkubasi pada suhu ruang 5-7 hari sampai kapang menghasilkan spora.
3.3.6. Kultur Inokulum Spora
Isolat kapang hasil peremajaan dengan medium MSSA, dimasukkan 10 ml NaCl 0,85 %. Spora kapang pada permukaan MSSA dicerai berai mengunakan
37
ose steril hingga larut. Larutan spora dituang ke dalam yellow tube, diberi label sesuai kode isolatnya dan divorteks (Fardiaz, 1992).
3.3.7. Pembuatan Medium Minimal Salt + Sugar (MSS)
Medium MSS dibuat dengan sebanyak 600 ml MS, ditambahkan sukrosa 0,1 % (0,6 g) dan ekstrak ragi 0,1 % (0,6 g). Campuran tersebut dihomogenkan dan dimasukan ke dalam 20 tabung Erlenmeyer masing-masing 30 ml, kemudian ditambahkan 5% serbuk batubara (1,5 g) ke dalam 20 Erlenmeyer tersebut. Erlenmeyer ditutup rapat dengan alumunium foil dan diautoklaf dengan suhu 121oC selama 15 menit.
3.3.8. Biosolubilisasi Batubara
Keempat kultur inokulum spora sebanyak 5 % diinokulasikan ke dalam 30 ml medium MSS yang telah ditambahkan batubara 1,5 g. Medium MSS tersebut diinkubasi menggunakan shaking incubator dengan kecepatan 150 rpm, pada suhu ruang, selama 28 hari. Pencuplikan sampel kultur dilakukan pada hari ke 0, 7, 14, 21, dan 28 menurut metode Scott dan Lewis, 1990.
Sampel kultur dimasukan ke dalam yellow tube dan diberi label, kemudian disentrifugasi untuk memisahkan endapan dari supernatannya. Sampel selanjutnya disaring dengan kertas whatman No.1. Supernatan yang didapatkan dianalisis pH, aktivitas enzim, asam humat dan fulvat, dan solubilisasi batubara dengan spektrofotometer UV-Vis dan GC-MS. Endapan batubara yang telah terpisah dikeringkan dalam oven pada suhu 55 oC untuk uji menggunakan FTIR.
38 3.3.9. Pengukuran pH Medium Sampel
Supernatan dari masing-masing sampel diukur nilai pH nya menggunakan pH meter yang telah dikalibrasi.
3.3.10. Pengukuran Aktivitas Enzim
Supernatan dimasukan 1 ml ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 4 ml KH2PO4. Reaksi dimulai dengan menambahkan 40 g FDA kemudian divortex dan inkubasi selama 20 menit. Setelah penginkubasian segera ditambahkan aseton sebanyak 4 ml untuk menghentikan reaksi kemudian tutup dengan alumunium foil. Suspensi disaring dengan kertas whatman N0. 1. Filtrat dimasukan ke dalam tabung reaksi , ditutup dengan kertas parafilm dan disimpan dalam es batu untuk menguapkan aseton. Nilai absorbansi diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm (Breeuwer, 1996).
3.3.11. Pengukuran Asam Fulvat dan Asam Humat • Asam Fulvat
Terhadap setiap sampel dilakukan perlakuan asam yakni dengan menambahkan asam klorida (HCl) 4 N hingga pH mencapai 1, setelah pH mencapai nilai yang diinginkan kemudian dilakukan sentrifugasi selama 20 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Dari proses tersebut didapatkan supernatan dan pellet yang terpisah di dasar tabung sentrifugasi. Supernatan yang didapatkan kemudian dipindahkan ke dalam tabung terpisah dan diukur absorbansinya menggunakan spekrofotometer pada panjang gelombang 280 nm (Fakuosa dan Frost, 1998).
39 • Asam Humat
Setelah proses asidifikasi menggunakan HCl 4 N, maka endapan yang didapatkan dari hasil sentrifugasi diperlakukan lebih lanjut yakni dengan membilasnya menggunakan aquadest hingga pH nya mencapai nilai 4. Setelah itu dilakukan pengukuran absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm (Fakuosa dan Frost, 1998).
3.3.12. Pengukuran Solubilisasi dengan Spektrofotometer UV-Vis
Supernatan hasil solubilisasi disentrifugasi 5400 rpm selama 15 menit kemudian diukur nilai absorbansinya menggunakan Spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 250 nm dan 450 nm untuk mengetahui tingkat solubilisasi batubara. Nilai absorbansi yang tinggi berbanding lurus dengan tingkat solubilisasi batubara yang tinggi pula, data tersebut digunakan sebagai dasar untuk menyeleksi isolat kapang. Supernatan (sampel) dengan nilai absorbsi (biosolubilisasi) tertinggi akan diuji lanjut menggunakan GC-MS (Selvi dan Banerje, 2007).
3.3.13. Analisis Sample dengan Menggunakan FTIR
Endapan batubara dianalisis dengan FTIR pada range frekuensi 4000- 450 cm-1 dengan resolusi 4 cm-1. Endapan batubara hasil biosolubilisasi terlebih dahulu dioven pada suhu 55 oC. Sebanyak 0,2 g sampel dibuat pellet dalam KBr dengan rasio 1:100. Sampel dicampurkan dengan serbuk KBr kering dengan lumpang agate atau vibrating Ball Mill hingga benar-benar homogen. Campuran tersebut dicetak dengan handy press. Cakram KBr yang sudah terbentuk dimasukan ke dalam KBr disc holder dan direkam dengan alat spektrofotometer
40
FTIR (Shi et al., 2009). Kontrol yang digunakan adalah batubara lignit yang belum diberi perlakuan biosolubilisasi.
3.3.14. Analisis Hasil Solubilisasi Batubara oleh Kapang dengan Menggunakan GC-MS
Supernatan hasil solubilisasi dan pelarut dicampur dengan perbandingan 1:1. Pelarut yang digunakan adalah benzena : heksana : dietil eter dengan perbandingan 3:1:1. campuran lalu diaduk, didiamkan beberapa saat sampai terbentuk fase atas dan bawah. Fase atas selanjutnya dimasukan ke dalam vial untuk dianalisis dengan alat GC-MS. Kontrol yang digunakan adalah batubara yang dilarutkan dalam medium minimal salt, kemudian diekstrak dengan pelarut yang sama. Kondisi optimum GC-MS yang digunakan sebagai berikut (Silva et al., 2007).
Tabel 7 . Kondisi Optimum GC-MS
Spesifikasi Keterangan
Nama kolom (RTX-1MS) Restax
Panjang kolom 30 m
Diameter kolom 0,25 mm
Ketebalan kolom 0,25 m df
Jenis kolom Non polar
Suhu kolom oven 50 oC
Suhu injeksi 280 oC
Cara injeksi Split
Cara kontrol aliran Kecepatan linear
Tekanan 90,7 kPa
Total aliran 19,9 mL/menit
Aliran kolom 1,54 mL/menit
Kecepatan linear 45 cm/detik
Jumlah sampel 5 l
Fase diam Polimethyl siloxane
Fase gerak Gas helium