METODOLOGI PENELITIAN
3.3 PROSEDUR KERJA .1 Penyiapan Simplisia .1Penyiapan Simplisia
Penyiapan simplisia buah bawang hutan dilakukan dengan cara sortasi basah untuk membersihkannya dari kotoran. Selanjutnya buah bawang hutan dihancurkan dan ditumbuk dengan menggunakan lumpang dan alu dan langsung diisolasi minyak atsiri yang terkandung di dalamnya. 3.3.2 Isolasi
3.3.2.1 Destilasi Uap Air
Isolasi buah bawang hutan dilakukan dengan menggunakan destilasi uap air. Sebanyak 200 gram buah bawang hutan yang sudah dirajang dan ditumbuk, didestilasi dengan menggunakan uap air selama ± 5 jam pada suhu diatas 100oC. Uap yang keluar dikumpulkan dan dibiarkan mengembun. Kemudian hasil destilasi yang diperoleh ditampung dalam corong pisah. Fase minyak dan fase air dipisahkan
menggunakan NaCl jenuh hingga diperoleh minyak atsirinya. Selanjutnya ditambahkan Na2SO4 anhidrat untuk menghilangkan air yang
masih tersisa. Minyak atsiri bebas air kemudian ditimbang selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri dan diidentifikasi kandungan kimianya menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrometry (Jamal, 2009). 3.3.2.2Enfleurasi
Sebanyak ± 30 gram lemak (dalam hal ini menggunakan adeps lanae atau lemak bulu domba) dioleskan secara merata dengan tebal 0,3 cm pada permukaan plat kaca (hal ini dilakukan pada 2 buah plat kaca). Buah bawang hutan sebanyak ± 180 gram yang telah dirajang dan ditumbuk diletakkan di dasar permukaan chamber. Setelah itu 2 plat kaca dimasukkan ke dalam dua sisi chamber dan membentuk pola segitiga dengan mempertemukan 2 buah sisi atas dari plat kaca. Setelah itu chamber ditutup dengan menggunakan penutup kaca yang bagian dalamnya telah dioleskan lemak sebanyak ± 20 gram. Kemudian chamber didiamkan pada suhu ruang.
Setelah 7 hari lemak kemudian diambil dari plat kaca dan ditimbang beratnya. Lemak kemudian dilarutkan ke dalam metanol pro analisis dengan perbandingan lemak : metanol = 1 : 2 dan dibiarkan selama 1 hari. Kemudian metanol diuapkan dengan menggunakan vaccum rotary evaporator. Minyak atsiri bebas metanol kemudian ditimbang selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri dan diitentifikasi kandungan kimianya menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrometry.
3.3.3 Analisis Senyawa menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrometry
Sebanyak 1 µL minyak atsiri yang didapatkan diinjeksikan ke injektor Gas Chromatography-Mass Spectrometry menggunakan detektor FID. Temperatur kolom ditingkatkan dari 70oC-100oC dengan rata-rata kenaikan 2 oC/menit, 100oC-150oC dengan rata-rata kenaikan 5oC/menit, dan dari 150oC-200oC dengan rata-rata kenaikan 10oC/menit. Kolom yang digunakan yaitu kolom kapiler (dimensi 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm), laju alir 1 ml/menit, gas pembawa berupa helium tekanan 80 kPa, suhu injektor
250 oC, suhu interface 280 oC. Parameter Mass Spectrometry berupa tegangan ionisasi sebesar 70 eV, suhu ion source (sumber ionisasi) 180 oC, rata-rata scanning 50-600 Da (Baharum et al, 2010).
3.3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan
Semua alat dan bahan yang digunakan untuk uji mikrobiologi disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit, kecuali untuk bahan yang terbuat dari karet disterilkan dengan cara direndam dalam alkohol 70 % dan jarum ose disterilkan dengan cara flambir pada nyala bunsen. Pengerjaan uji mikrobiologi dilakukan secara aseptis di dalam lemari aseptis yang sebelumnya telah dibersihkan dengan alkohol 70 % lalu disinari dengan lampu UV selama 2 jam yang dinyalakan 15 menit sebelum digunakan (Harley, 2005).
3.3.5 Pembuatan Media Pertumbuhan a. Nutrien Agar
Serbuk NA sebanyak 23 gram dilarutkan dalam 1 liter aquades dan dipanaskan sampai mendidih hingga semuanya larut. Lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
Komposisi NA (g/L): Agar 15; gelatin pepton 5; Beef extract 3. b. Nutrient Broth
Ditimbang 13 gr BHI NB dilarutkan dengan 1 L aquadest dan dipanaskan hingga semuanya larut kemudian disterilkan dalam autoklaf.
Komposisi NB (g/L): Lab-Lenco powder 1; Yeast extract 2; Peptone 5; dan Sodium chlorida 5.
3.3.6 Pembuatan Larutan Uji
Setiap larutan uji dibuat emulsi dengan menggunakan cara mencampur minyak atsiri buah bawang hutan dengan pelarut aquadest steril dan 0,5% Tween 80. Konsentrasi yang dibuat untuk semua bakteri terdiri dari 125 ppm; 250 ppm; 500 ppm; 1000 ppm; 2000 ppm baik hasil dari destilasi uap air maupun hasil enfleuransi (Hosamani et al., 2011).
3.3.7 Pembuatan Stok Bakteri
Semua bakteri uji diinokulasikan pada medium NA dengan cara menggoreskan bakteri menggunakan jarum ose pada permukaan agar, kemudian diinkubasi pada suhu 37 OC selama 24 jam (Suppakul et al., 2006; Kumar et al., 2010).
3.3.8 Pembuatan Suspensi Bakteri
Biakan bakteri yang telah berumur 24 jam pada NA diambil satu ose dan disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 2 mL NaCl 0,9%. Kemudian divortex dan diukur menggunakan Spectrophotometry, setelah itu diencerkan hingga diperoleh suspensi 106 sel bakteri/mL sesuai dengan standard Mc Farland III (109 sel bakteri/mL) sebagai acuan (Azrifitria et al., 2010).
3.3.9 Pengujian Aktivitas Antibakteri
1. Pengujian Aktivitas Antibakteri Minyak atsiri dari Hasil Destilasi Uap Air dan Enfleurasi
Penentuan KHM dan KBM dilakukan dengan menggunakan metode dilusi cair/broth dilution test (serial dilution). Konsentrasi larutan uji dibuat sebuah seri pengenceran pada medium cair dengan volume total 3 ml dengan konsentrasi larutan uji 125 ppm; 250 ppm; 500 ppm; 1000 ppm; 2000 ppm yang kemudian ditambahkan dengan suspensi bakteri uji sebanyak 0,3 ml dan 1,2 ml NB. Kemudian di shaker dan diinkubasi pada suhu 37OC selama 24 jam dalam kondisi aerob. Sebagai pembanding digunakan empat macam kontrol yaitu:
a. Kontrol bakteri = 2,7 ml medium + 0,3 ml suspensi bakteri b. Kontrol pelarut = 1,5 ml medium + 1,5 ml pelarut
c. Kontrol ekstrak = 1,5 ml medium + 1,5 ml ekstrak
Nilai KHM dinyatakan sebagai konsentrasi terendah minyak atsiri buah bawang hutan yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Sedangkan nilai KBM akan dicari lebih lanjut berdasarkan nilai KHM yang diperoleh. Nilai KBM dinyatakan sebagai konsentrasi terendah minyak atsiri buah bawang hutan yang tidak menunjukkan
adanya pertumbuhan koloni bakteri pada agar. Pengujian dilakukan 2 kali pengulangan (Azrifitria et al., 2010; Suppaku et al., 2006).
2. Pengujian Aktivitas Antibakteri Cyprofloxacin sebagai Antibakteri Pembanding
Pentuan KHM dan KBM dilakukan dengan menggunakan metode dilusi cair/broth dilution test (serial dilution). Konsentrasi larutan uji dibuat sebuah seri pengenceran pada medium cair dengan volume total 3 ml dengan konsentrasi larutan uji sebagai berikut:
a. Untuk S. aureus 0,03125 ppm; 0,0625 ppm; 0,125 ppm; 0,25 ppm; 0,5 ppm b. Untuk B. cereus 0,015625 ppm; 0,03125 ppm; 0,0625 ppm; 0,125 ppm; 0,25 ppm c. Untuk B. subtilis 0,03125 ppm; 0,0625 ppm; 0,125 ppm; 0,25 ppm; 0,5 ppm d. Untuk E.coli 0,225 ppm; 0,45 ppm; 0,9 ppm; 1,8 ppm; 3,6 ppm e. Untuk P. aeruginosa 0,125 ppm; 0,25 ppm; 0,5 ppm; 1 ppm; 2 ppm f. Untuk S. typhimurium 0,0625 ppm; 0,125 ppm; 0,25 ppm; 0,5 ppm; 1 ppm
Yang kemudian ditambahkan dengan suspensi bakteri uji sebanyak 0,3 ml dan 1,2 ml NB. Kemudian di shaker dan diinkubasi pada suhu 37OC selama 24 jam dalam kondisi aerob. Sebagai pembanding digunakan empat macam kontrol yaitu:
a. Kontrol bakteri = 2,7 ml medium + 0,3 ml suspensi bakteri b. Kontrol pelarut = 1,5 ml medium + 1,5 ml pelarut
c. Kontrol ekstrak = 1,5 ml medium + 1,5 ml ekstrak
Nilai KHM dinyatakan sebagai konsentrasi terendah cyprofloxacin yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri uji. Pengujian dilakukan 2 kali pengulangan (Azrifitria et al., 2010).
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN