BAHAN DAN METODE PENELITIAN
PROSEDUR PENELITIAN
Pada Gambar 21 dapat dilihat bahwa prosedur penelitian terbagi ke dalam 5 tahap yakni; (1) Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering, (2) Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase, (3) Ekstraksi enzimatik buah vanili segar; (a) Satu jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol serta (b) Dua atau tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol, (4) Optimasi ekstraksi enzimatik dan (5) Pengamatan terhadap kadar air, serat pangan, vanilin, glukosa dan padatan terlarut.
Gambar 21 Diagram alir tahapan penelitian Tahap 1:
1.Karakterisasi kimia - Air
- Serat pangan - Vanilin
2.Ekstraksi vanili kering tanpa enzim komersial dengan pelarut etanol Parameter : Vanilin Buah Vanili Kering Segar Tahap 2: Penentuan suhu inkubasi optimum enzim β-glukosidase Parameter : Vanilin Tahap 4:
Optimasi ekstraksi enzimatik 1.Penentuan konsentrasi enzim Parameter : Vanilin
2.Penentuan waktu inkubasi enzim Parameter : Vanilin
Tahap 3:
Ekstraksi enzimatik
1.Satu jenis enzim komersial dengan pelarut etanol/air
2.Dua/tiga jenis enzim komersial dengan pelarut etanol
Parameter: Vanilin
Ekstrak Terbaik
Karakterisasi Kimia Buah Vanili Segar dan Kering
Karakterisasi kimia buah vanili segar dan kering merupakan tahap awal dari penelitian ini. Karakterisasi kimia bertujuan untuk mengetahui kadar senyawa- senyawa penting dalam buah vanili segar dan kering, yang dapat mendukung penelitian. Analisis kimia yang dilakukan antara lain kadar air dengan metode gravimetri, serat pangan metode enzimatik dan vanilin metode spektrofotometri.
Disamping itu, pada tahap ini pun dilakukan penentuan kadar vanilin dari ekstrak vanili kering yang berfungsi sebagai kontrol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar yang diproses secara enzimatik. Prosedur ekstraksi vanili kering antara lain dengan menimbang sejumlah vanili kering (perhitungan bahan kering disamakan dengan bahan kering vanili segar), lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan ditambahkan aquadest 10 ml. Reaksi dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 500C menggunakan shaker water bath 150 rpm. Kemudian ekstraksi dilanjutkan dengan penambahan etanol 47.5%v/v selama 30 menit. Campuran diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Setelah itu ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri.
Penentuan Suhu Inkubasi Optimum Enzim β-Glukosidase
Penentuan suhu optimum aktifitas enzim β-glukosidase dilakukan dengan memvariasikan suhu inkubasi pada 30, 37, 45 dan 500C. Prosedurnya antara lain dengan menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar setelah pengeringan beku), lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan ditambahkan enzim β-glukosidase 1 ml serta aquadest 9 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 30, 37, 45 dan 500C menggunakan
shaker water bath 150 rpm dan dilanjutkan 30 menit dengan penambahan etanol 47.5%v/v. Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh, diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Suhu inkubasi enzim β-glukosidase yang menghasilkan kadar vanilin tertinggi dianggap sebagai suhu optimum bagi aktifitas enzim β-glukosidase dan kondisi suhu tersebut digunakan untuk inkubasi enzim β-glukosidase pada tahapan
penelitian berikutnya yakni ekstraksi enzimatik serta optimasi ekstraksi enzimatik buah vanili segar.
Ekstraksi Enzimatik Buah Vanili Segar
Ekstraksi enzimatik buah vanili segar bertujuan untuk mengetahui bagaimana pengaruh penggunaan enzim komersial tunggal atau kombinasinya dengan atau tanpa etanol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar. Pada tahap ini digunakan konsentrasi enzim, jumlah vanili segar, suhu, waktu inkubasi serta konsentrasi larutan etanol berdasarkan hasil penelitian Ruiz- Teran et al. (2001) sebagai acuan. Ekstraksi enzimatik buah vanili segar terdiri dari 2 bagian yakni;
Penambahan Satu Jenis Enzim Komersial dengan Pelarut Air dan atau
Etanol
Tahap ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh penggunaan enzim selulase, pektinase dan β-glukosidase komersial secara tunggal serta pelarut yakni air dan atau etanol terhadap kadar vanilin ekstrak vanili segar. Pada tahap ini terdapat 2 prosedur berdasarkan jenis pelarut yang digunakan. Prosedur pertama adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan air sebagai pelarut yakni dengan menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar setelah pengeringan beku) lalu dimasukkan ke dalam tabung tertutup dan ditambahkan 1 jenis enzim sebanyak 1 ml serta aquadest 9 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 500C menggunakan shaker water bath 150 rpm. Sebagai prosedur kedua adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan air dan etanol 95% sebagai pelarut. Prosedurnya sama dengan prosedur 1, namun setelah reaksi berlangsung selama 8 jam, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan proses ekstraksi dilanjutkan selama 30 menit. Disamping itu, dilakukan ekstraksi menggunakan pelarut air dengan atau tanpa etanol, tapi tanpa penambahan enzim.
Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh dari kedua prosedur di atas, diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Pada Tabel 1 dapat dilihat perlakuan penggunaan 1 jenis enzim komersial berikut perlakuan pelarut untuk ekstraksi.
Tabel 1 Rekapitulasi perlakuan 1 jenis enzim komersial dengan pelarut air dan atau etanol untuk ekstraksi
Perlakuan Penambahan 1 2 3 4 5 6 7 8 air a air+etanolb selulase+airc selulasel+air+etanol pektinase+air pektinase+air+etanol β-glukosidase+air β-glukosidase+air+etanol Keterangan:
1.aair 10 ml ditambahkan pada 3.33 g vanili segar, lalu reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 500C.
bair 10 ml diditambahkan pada 3.33 g vanili segar, setelah reaksi berlangsung 8 jam pada suhu
500C, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan reaksi dilanjutkan selama 30 menit. cselulase 1 ml ditambahkan pada 9 ml air lalu reaksi berlangsung 8 jam pada suhu 500C.
2.Jumlah vanili (3.33 g) dikonversikan terlebih dahulu, apabila digunakan vanili yang telah melalui proses pengeringan beku. Misalnya: berat vanili segar sebelum pengeringan beku adalah 3.33 g dengan kadar air 82.28%, maka berat keringnya 0.5901. Jika digunakan vanili segar setelah pengeringan beku dengan berat kering yang sama, maka jumlah yang digunakan sebesar 0.6464 g.
Hasil dari penelitian tahap ini akan memberikan informasi jenis pelarut yang mampu menghasilkan kadar vanilin lebih tinggi, sehingga selanjutnya jenis pelarut tersebut digunakan pada perlakuan ekstraksi dengan penambahan kombinasi enzim. Disamping itu, kadar vanilin ekstrak yang dihasilkan dari setiap perlakuan penggunaan enzim tunggal, selanjutnya dibandingkan dengan perlakuan kombinasi enzim. Kemudian dilakukan optimasi konsentrasi dan waktu inkubasi enzim terhadap perlakuan ekstraksi enzimatik yang menghasilkan kadar vanilin tertinggi, sehingga diperoleh kadar vanilin ekstrak optimum.
Penambahan Dua atau Tiga Jenis Enzim Komersial dengan Pelarut Air dan Etanol
Tahap ini dilakukan untuk mengetahui efek sinergisme enzim selulase, pektinase dan β-glukosidase sehingga dapat ditentukan apakah ketiga enzim komersial tersebut lebih efektif digunakan secara tunggal atau kombinasi. Pada tahap ini terdapat 2 prosedur berdasarkan jumlah enzim yang digunakan. Prosedur pertama adalah ekstraksi enzimatik menggunakan 2 jenis enzim yakni dengan menimbang 3.33 g vanili segar (dikonversikan menjadi berat vanili segar
setelah pengeringan beku) lalu dimasukan ke dalam gelas tertutup dan ditambahkan enzim I dan enzim II masing- masing sebanyak 1 ml dan aquadest 8 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 500C menggunakan shaker water bath 150 rpm. Setelah ekstraksi enzimatik, ditambahkan 10 ml etanol 95%, lalu proses ekstraksi dilanjutkan selama 30 menit. Sebagai prosedur kedua adalah ekstraksi enzimatik yang menggunakan 3 jenis enzim, dimana prosedurnya sama dengan prosedur 1, tapi ditambahkan enzim III yakni β-glukosidase sebanyak 1 ml sehingga jumlah air yang digunakan adalah 7 ml. Reaksi enzimatik dibiarkan berlangsung selama 8 jam pada suhu 500C. Setelah ekstraksi enzimatik, ditambahkan 10 ml etanol 95%, lalu proses ekstraksi dilanjutkan selama 30 menit.
Setiap hasil ekstraksi yang diperoleh dari kedua prosedur di atas, diencerkan dengan aquadest sampai tanda batas 25 ml labu ukur. Ekstrak disaring melalui kertas saring Whatman No.1 dan diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri. Pada Tabel 2 dapat dilihat perlakuan penggunaan 2 atau 3 jenis enzim komersial untuk ekstraksi.
Tabel 2 Rekapitulasi perlakuan 2 atau 3 jenis enzim komersial dengan pelarut air dan etanol untuk ekstraksi
Perlakuan Penambahan 1 2 3 4 selulase+pektinasea selulase+β-glukosidase pektinase+β-glukosidase selulase+pektinase+β-glukosidaseb Keterangan:
1. aselulase 1 ml dan pektinase 1 ml ditambahkan pada 8 ml air, setelah reaksi berlangsung 8 jam
pada suhu 500C, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan reaksi dilanjutkan selama 30 menit.
bselulase 1 ml, pektinase 1 ml dan β-glukosidase 1 ml ditambahkan pada 7 ml air, setelah reaksi
berlangsung 8 jam pada suhu 500C, ditambahkan 10 ml etanol 95% dan reaksi dilanjutkan
selama 30 menit.
2. Jumlah vanili (3.33 g) dikonversikan terlebih dahulu, apabila digunakan vanili yang telah
melalui proses pengeringan beku.. Misalnya: berat vanili segar sebelum pengeringan beku
adalah 3.33 g dengan kadar air 82.28%, maka berat keringnya 0.5901. Jika digunakan vanili segar setelah pengeringan beku dengan berat kering yang sama, maka jumlah yang digunakan sebesar 0.6464 g.
Kadar vanilin ekstrak yang dihasilkan dari setiap perlakuan kombinasi enzim, selanjutnya dibandingkan dengan perlakuan penggunaan enzim tunggal. Kemudian dilakukan optimasi konsentrasi dan waktu inkubasi enzim terhadap perlakuan ekstraksi enzimatik yang menghasilkan kadar vanilin tertinggi, sehingga diperoleh kadar vanilin ekstrak optimum.
Optimasi Ekstraksi Enzimatik
Pada tahap ini dilakukan optimasi ekstraksi enzimatik untuk memperoleh kadar vanilin ekstrak optimum dengan penambahan enzim komersial secara efisien. Adapun optimasi ekstraksi enzimatik yang dilakukan antara lain;
Penentuan Konsentrasi Optimum Enzim Terbaik
Berdasarkan hasil percobaan pada tahap 3 akan diketahui ekstrak terbaik dengan kadar vanilin tertinggi yang diperoleh melalui penambahan enzim tertentu dengan pelarut air dan atau etanol. Selanjutnya untuk menentukan unit aktifitas enzim optimum dilakukan prosedur percobaan yang sama, tapi unit aktifitas enzim yang ditambahkan divariasikan. Dari percobaan ini akan diketahui berapa jumlah enzim yang diperlukan agar seluruh substrat yang terdapat dalam buah dapat berikatan dengan enzim secara optimal, dimana hal ini ditunjukkan dengan kadar vanilin bebas dalam ekstrak yang mencapai batas optimum.
PenentuanWaktu InkubasiOptimumEnzim β-glukosidase
Setelah diketahui konsentrasi enzim optimum, lalu dilakukan penentuan waktu inkubasi optimum dengan prosedur yang sama. Hal ini bertujuan untuk meningkatkan efisiensi ekstraksi enzimatik. Pada tahap ini waktu inkubasi divariasikan, lalu ekstrak diukur kadar vanilinnya dengan metode spektrofotometri.
Pengamatan
Pengamatan yang dilakukan meliputi analisis kadar air, serat pangan,
vanilin, glukosa dan padatan terlarut dalam ekstrak.
Kadar Air Metode Gravimetri (Apriyantono dkk. 1989)
Penetapan kadar air buah vanili segar dan kering sebelum dan sesudah pengeringan beku dilakukan dengan metode gravimetri. Cawan alumunium
kosong dikeringkan dalam oven selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator selama 10 menit kemudian ditimbang. Selanjutnya sampel sebelum pengeringan bekuditimbang sebanyak kurang lebih 5 g untuk analisis kadar air buah awal dan sampel setelah pengeringan beku ditimbang kurang lebih 0,5 g. Setelah itu dimasukkan ke dalam oven selama sekitar 16 jam hingga diperoleh berat tetap. Cawan beserta is inya dipindahkan ke dalam desikator, didinginkan lalu ditimbang. Perhitungan:
% kadar air (berat kering) = 100 2 3
x w w
% kadar air (berat basah) = 100 1 3x w w Keterangan: w1 = berat sampel (g)
w2 = berat sampel setelah dikeringkan(g) w3 = kehilangan berat (g)
Kadar Serat Pangan Metode Enzimatik (Asp et al. 1993)
Serat pangan (serat makanan) adalah bagian dari makanan yang tidak dapat dihidrolisis oleh enzim-enzim pencernaan, meliputi selulosa, hemiselulosa, lignin, pentosan, gum dan senyawa pektik. Analisis serat pangan meliputi homogenisasi dan liofilisasi. Prosedur analisisnya antara lain; sampel digiling menggunakan petroleum eter pada suhu kamar selama 15 menit (40 ml petroleum eter per gram sampel). Lalu ditimbang 1 g sampel dan dimasukan ke dalam erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 25 ml 0.1 M buffer Na2PO4 pH 6 dan diaduk merata. Enzim Termamyl ditambahkan 0.1 ml dan erlenmeyer ditutup dengan alumunium foil. Lalu diinkubasi di dalam penangas air pada suhu 1000C selama 15 menit. Campuran dibiarkan dingin dan ditambahkan 20 ml air destilata, atur pH menjadi 1.5 menggunakan HCl. Kemudian ditambahkan 100 mg Pepsin, erlenmeyer ditutup dan diinkubasi di dalam penangas air bergoyang pada suhu 400C selama 60 menit. Setelah itu 20 ml air destilata ditambahkan dan atur pH menjadi 6.8 menggunakan NaOH. Sebanyak 100 mg Pankreatin ditambahkan, erlenmeyer ditutup dan diinkubasi di dalam penangas air bergoyang pada suhu 400C selama 60 menit. Lalu pH diatur menggunakan HCl. Campuran kemudian disaring
menggunakan crucible (porosity 2) yang telah diketahui beratnya dan mengandung 0.5 celite kering, lalu dibilas dengan 2x10 ml air destilata.
- Residu (serat yang tidak larut)
Dari prosedur di atas, selanjutnya residu (serat yang tidak larut) dibilas dengan 2x10 ml etanol 95% dan 2x10 ml aseton. Kemudian dikeringkan pada suhu 1050C sampai mencapai berat konstan (semalam). Lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (D1). Selanjutnya diabukan pada suhu 5500C selama 5 jam. Lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (I1).
- Filtrat (serat yang larut)
Volume filtrat diatur menjadi 100 ml. Selanjutnya 400 ml etanol 95% hangat (600C) ditambahkan dan dibiarkan mengendap selama 1 jam. Larutan disaring menggunakan crucible (porosity 2) yang telah diketahui beratnya dan mengandung 0.5 celite kering. Serat yang larut dibilas dengan 2x10 ml etanol 78%, 2x10 ml etanol 95% dan 2x10 ml aseton. Kemudian dikeringkan pada suhu 1050C selama semalam. Lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (D2). Selanjutnya diabukan pada suhu 5500C selama 5 jam. Lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang (I2).
Blanko untuk serat yang tidak larut dan serat larut diperoleh melalui cara yang sama dengan prosedur untuk sampel, tapi tanpa sampel (B1 dan B2). Nilai blanko ini sewaktu-waktu harus dicek.
Perhitungan:
% serat pangantidak larut = x100 W
B1 I1 D1− −
% serat panganlarut = x100 W
B2 I2 D2− −
% serat pangantotal = x100 W B I D− − Keterangan: W = berat sampel (g)
D = berat setelah pengeringan (g) I = berat setelah pengabuan (g) B = berat blanko bebas abu (g)
Kadar Vanilin Buah Vanili Metode Spektrofotometri (Hayani dan Fatimah 2002)
Kurva standar vanilin yang digunakan untuk penentuan kadar vanilin buah adalah sama dengan kurva standar yang dipakai untuk penentuan kadar vanilin dalam ekstrak vanili. Adapun penentuan kadar vanilin dalam buah dilakukan dengan menimbang 5 g vanili kering. Jumlah ini dikonversikan dulu apabila digunakan buah vanili segar atau kering yang telah melalui perlakuan pengeringan beku (Lampiran 5). Selanjutnya buah vanili direndam selama 24 jam dengan 70 ml alkohol 60% di dalam erlenmeyer tertutup. Campuran disaring dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan alat penyaring vakum dan dibilas dengan alkohol 60%, lalu ditepatkan dengan penambahan alkohol 60% hingga tanda batas dalam labu ukur 100 ml. Kemudian larutan dipipet sebanyak 10 ml, dimasukan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan aquadest hingga tanda batas (larutan X). Larutan X dipipet sebanyak 2 ml, dimasukan ke dalam labu ukur 25 ml dan ditambahkan aquadest hingga tanda batas. Disisi lain, larutan X dipipet sebanyak 2 ml, dimasukan ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan 1 ml NaOH 0.1N dan diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas.
Perhitungan :
Kadar vanilin atas dasar bahan kering (µg/g) =
%) % 100 ( 25 H M x fp x X − Keterangan:
X = konsentrasi larutan sampel yang terbaca di spektrofotometer (µg/ml) fp = faktor pengenceran (500)
M = massa sampel (g)
H% = kadar air setelah pengeringan beku
Kadar Vanilin Ekstrak Metode Spektrofotometri (AOAC 36.2.07 1995, revisi Maret 1998)
Sampel ekstrak vanili segar yang telah disaring dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan alat penyaring vakum, selanjutnya dianalisis dengan spektrofotometer double beam. Sebanyak 10 ml larutan sampel dipipet ke dalam 100 ml labu ukur, diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas. Pada labu ukur lainnya, ditambahkan 80 ml aquadest dan 1 ml NaOH 0.1N, lalu diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas. Pengenceran dapat disesuaikan,
agar sampel memiliki nilai absorbansi antara 0.2-0.8. Nilai absorbansi dari larutan basa ditentukan pada 348 nm menggunakan larutan netral sebagai blanko. Lalu kandungan vanilin sampel diukur melalui kurva standar.
Kurva standar dibuat dengan cara melarutkan 0.1 g vanilin dengan 5 ml alkohol 99.8% di dalam labu ukur 100 ml. Lalu larutan dipipet 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 dan 10 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml. Aquadest ditambahkan hingga tanda batas (larutan X). Kemudian masing- masing larutan X dipipet sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Aquadest ditambahkan hingga tanda batas. Disisi lain, larutan X dipipet masing- masing 5 ml lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml. Setelah it u, sebanyak 1 ml NaOH 0.1 N ditambahkan dan larutan diencerkan dengan aquadest hingga tanda batas. Nilai absorbansi dari larutan basa ditentukan pada 348 nm menggunakan larutan netral sebagai blanko, lalu dibuat kurva standar.
Kadar Glukosa Ekstrak Vanili Metode Somogy-Nelson (Unpas 2003)
Metode ini cukup akurat untuk mengukur kadar gula pereduksi karena warna yang terbentuk stabil. Kurva standar dibuat dengan cara melarutkan 0.02 g glukosa standar dengan air bebas mineral di dalam labu ukur 100 ml. Larutan tersebut dipipet 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8 dan 2 ml, lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan air bebas mineral hingga mencapai 2 ml. Kemudian ke dalam setiap tabung yang berisi larutan glukosa tersebut ditambahkan pereaksi Somogy I sebanyak 1.6 ml dan Somogy II sebanyak 0.4 ml. Lalu larutan dikocok secara homogen dan ditutup dengan kelereng. Setelah itu dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit. Lalu didinginkan dan ditambahkan pereaksi Nelson sebanyak 2 ml serta air bebas mineral 4 ml. Larutan dikocok hingga gas CO2 keluar dan nilai absorbansi diukur pada ? 520 nm. Blanko dibuat sama dengan di atas, tapi sampel diganti dengan air bebas mineral. Prosedur analisis gula pereduksi yang terdapat dalam ekstrak vanili pun sama dengan pembuatan standar. Larutan sampel (ekstrak vanili) sebanyak 10 ml dimasukan ke dalam labu ukur 25 ml. Kemudian larutan Pb asetat jenuh dan air bebas mineral ditambahkan kedalamnya hingga tanda batas. Larutan dikocok merata dan disaring dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan alat penyaring vakum. Untuk menghilangkan kelebihan Pb yang digunakan dalam
penjernihan, ditambahkan Na oksalat anhidrat 1 g ke dalam filtrat. Larutan kemudian disaring kembali dengan kertas saring Whatman No.1 menggunakan alat penyaring vakum sebanyak 2 kali agar filtrat benar-benar jernih. Selanjutnya filtrat dipipet sebanyak 1 ml dan diencerkan dengan air bebas mineral hingga tanda batas labu ukur 50 ml. Lalu sebanyak 1 ml larutan dimasukan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan air bebas mineral 1 ml, lalu dilakukan prosedur analisis seperti pada pembuatan standar gula pereduksi. Perlu diperhatikan bahwa sampel harus bebas impuritas dan pemanasan serta pendinginan sampel dengan standar harus seragam.
Perhitungan :
Kadar glukosa atas dasar bahan kering ekstrak (µg/ml) =
Vs Va x fp x X Keterangan:
X = konsentrasi larutan sampel yang terbaca di spektrofotometer (µg/ml) fp = faktor pengenceran
Va = volume akhir Vs = volume sampel (ml)
Kadar Padatan Terlarut
Kadar padatan terlarut dalam ekstrak vanili segar dan kering diukur dengan 2 metode yakni gravimetri dan refraktrometri. Pengukuran kadar padatan terlarut dengan metode gravimetri dilakukan untuk perhitungan kadar vanilin ekstrak atas dasar berat kering. Prosedurnya antara lain; cawan porselen dikeringkan dalam oven selama 24 jam dan didinginkan dalam desikator selama 10 menit kemudian ditimbang. Selanjutnya ekstrak vanili segar sebanyak 2.5 g dimasukan ke dalam cawan. Lalu dikeringkan menggunakan oven suhu 1050C selama sekitar 20 jam hingga diperoleh berat tetap. Cawan beserta isinya dipindahkan ke dalam desikator, didinginkan lalu ditimbang.
Perhitungan:
% kadar padatan terlarut = 100 1 2 x w w Keterangan: w1 = berat sampel (g)