Prosedur Penelitian - BAHAN DAN METODE PENELITIAN

BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.3. Prosedur Penelitian

3.3.1. Pembuatan Larutan Pereaksi

3.3.1.1. Larutan Induk Standar Tyrosin 1000 mg/L

Ditimbang 1 g tyrosin dan ditambahkan HCl 1 N sedikit demi sedikit hingga larut kemudian dimasukkan kedalam labu takar 1000 mL dan diencerkan dengan akuades sampai garis tanda dan dihomogenkan. Diperoleh larutan induk standar tyrosin 1000 mg/L.

3.3.1.2. Larutan Standar Tyrosin 100 mg/L

Dipipet 100 mL larutan induk standar tyrosin 1000 mg/L dan dimasukkan kedalam labu takar 1000 mL kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda dan dihomogenkan. Diperoleh larutan standar tyrosin 100 mg/L.

3.3.1.3. Larutan Seri Standar Tyrosin

Dibuat konsentrasi larutan seri standar tyrosin bervariasi 10;20;30;40;50;60;70;80;90 mg/L. Masing-masing dipipet sebanyak 2,5 ; 5 ; 7,5 ; 10 ; 12,5 ; 15 ; 17,5 ; 20 ; 22,5 mL larutan standar 100 mg/L dan dimasukkan kedalam labu takar 25 mL kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda dan dihomogenkan.

3.3.1.4. Larutan Kasein 1%

Dilarutkan 1 g kasein dengan buffer phosfat pH 7 kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan diencerkan sampai garis tanda.

3.3.1.5. Larutan Asam Trikloroasetat 30%

Dilarutkan 30 g asam trikloroasetat dengan akuades kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan diencerkan sampai garis tanda.

3.3.1.6. Larutan Buffer Phosfat Larutan A : Larutan NaH2PO4.H2 Larutan B : Larutan Na

O ( 3,174 g dalam 100 mL akuades ) 2HPO4 ( 2,84 g dalam 100 mL akuades )

X mL Larutan A + Y mL Larutan B, dimasukkan kedalam labu takar 25 mL dan diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.

pH X Y 6 10,96 mL 1,54 mL 6,5 8,56 mL 3,937 mL 7 4,875 mL 7,625 mL 7,5 2 Ml 10,5 mL 8 0,66 mL 11,83 mL Tabel 2. Pembuatan Larutan Buffer Phosfat pH 6-8

3.3.1.7. Larutan Crude Enzim Papain 1%

Dilarutkan 1 g crude enzim papain dengan buffer phosfat pH 7 kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan diencerkan sampai garis tanda.

3.3.1.8. Larutan Alkohol 92%

Dimasukkan 96 mL alkohol 96% dalam labu takar 100 mL kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.

3.3.1.9. Larutan CH3

Dimasukkan 0,57 mL CH COOH 0,1N

3COOH glassial dalam labu takar 100 mL kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.

3.3.1.10. Larutan CH3

Dimasukkan 0,1 mL CH COOH 0,1%

3COOH glassial dalam labu takar 100 mL kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.

3.3.1.11. Larutan NaOH 0,1N

Dilarutkan 0,4 g NaOH dengan akuades kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 100 mL dan diencerkan sampai garis tanda.

3.3.1.12. Larutan NaOH 0,2N

Dilarutkan 2 g NaOH dengan akuades kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 250 mL dan diencerkan sampai garis tanda.

3.3.1.13. Larutan HCl 1N

Dilarutkan 8,33 mL HCl(p) dalam labu takar 100 mL kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.

3.3.1.14. Pereaksi Biuret

Dilarutkan 3 g CuSO4.5H2O dan 9 g Na-K-Tartrat dengan NaOH 0,2 N kemudian dimasukkan kedalam labu takar 500 mL dan diencerkan sampai garis tanda, kemudian ditambahkan 5 g KI dan dimasukkan kedalam labu takar 1000 mL dan diencerkan dengan NaOH 0,2 N sampai garis tanda.

3.3.2. Pembuatan Kurva Kalibrasi Tyrosin 3.3.2.1. Penentuan λmaks

Diambil larutan seri standar tyrosin 10 mg/L dan diukur λ

Larutan Standar Tyrosin

maks dengan melihat

spectrum puncak serapan maksimum tyrosin kemudian dilakukan pemeriksaan peak spectrum tyrosin dan diperoleh λmaks pada absorbansi maksimum.

3.3.2.2. Penentuan Kurva Kalibrasi Larutan Standar Tyrosin

Dinolkan absorbansinya dengan blanko akuades. Masing-masing larutan seri standar tyrosin 0;10;20;30;40;50;60;70;80;90 mg/L diukur absorbansinya pada λmaks 274 nm lalu diplotkan konsentrasi dan absorbansi larutan seri standar

3.3.3. Pembuatan Kurva Kalibrasi Bovin Serum Albumin ( BSA ) Metode Biuret 3.3. 3.1. Penentuan λmaks

Diambil salah satu konsentrasi larutan standar BSA dan diukur λ

Larutan BSA

maks dengan melihat spectrum puncak serapan maksimum BSA kemudian dilakukan pemeriksaan

peak spectrum BSA dan diperoleh λmaks pada absorbansi maksimum.

3.3.3.2. Penentuan Kurva Kalibrasi Larutan BSA

Dinolkan absorbansinya dengan blanko akuades. Dipipet masing-masing 0;0,1;0,2;0,4;0,6;0,8;1 mL larutan standar BSA dan ditambahkan masing-masing akuades hingga volume total masing-masing menjadi 4 ml kemudian ditambahkan masing-masing 6 ml pereaksi biuret, diukur absorbansinya pada λmaks 549 nm lalu diplotkan konsentrasi dan absorbansi larutan seri standar

3.3.4. Preparasi Sampel Getah Buah Pepaya ( Carica papaya L )

Digores buah pepaya Bangkok muda dengan pisau dan ditampung getah buah pepaya tersebut dalam gelas beaker.

3.3.5. Isolasi Crude Enzim Papain dari Getah Buah Pepaya ( Carica papaya L ) Sebanyak 7 ml getah buah pepaya ( 26,9685 g ) dimasukkan kedalam gelas beaker 100 mL, kemudian ditambahkan alkohol 92% sebanyak lima kali dari volume getah buah pepaya dan diisimpan pada suhu 10^oC selama 1 malam kemudian disaring. Dikeringkan residunya dalam oven vakum pada suhu 40^oC sampai berat konstan.

3.3.6. Penentuan Kadar Protein Crude Enzim Papain Metode Biuret

Dipipet 1 mL larutan crude enzim papain 1% dan dimasukkan kedalam gelas beaker 100 mL dan ditambahkan akuades hingga volume total adalah 4 ml, ditambahkan 6 ml Pereaksi Biuret dan didiamkan selama 16 menit pada suhu kamar, dan diukur absorbansinya pada λmaks 549 nm.

3.3.7. Imobilisasi Crude Enzim Papain

3.3.7.1. Imobilisasi Crude Enzim Papain Dengan Kappa karagenan

Disediakan 2 gelas beaker, Dalam gelas beaker I dimasukkan sebanyak 0,6 g Kappa karagenan dan dilarutkan dengan 20 mL akuades, kemudian dipanaskan pada suhu 70ôC sambil diaduk. Kemudian didiamkan hingga suhu 50ôC. Dalam gelas beaker II dimasukkan sebanyak 0,3 g crude enzim papain dan dilarutkan dengan 10 mL buffer phosfat pH 7 dan diaduk. Dicampurkan larutan Kappa karagenan kedalam larutan crude enzim papain dan dibiarkan dingin pada suhu kamar, kemudian ditambahkan 10 ml KCl 0,3M dan disimpan pada suhu 10ôC selama 1 malam, dipotong-potong dengan ukuran 5x5x5 mm dan dicuci dengan akuaes. Kemudian larutannya diuji dengan metode Biuret.

3.3.7.2. Imobilisasi Crude Enzim Papain Dengan Kappa karagenan dan Kitosan Disediakan 2 gelas beaker, Dalam gelas beaker I dimasukkan sebanyak 0,9 g Kappa karaginan dan dilarutkan dengan 30 mL akuades, kemudian dipanaskan pada suhu 70^oC. Kemudian didiamkan hingga suhu 50^oC. Dalam gelas beaker II dimasukkan sebanyak 0,3 g kitosan dan dilarutkan dengan 10 mL Asam asetat 0,1%

dan diaduk kemudian ditambahkan larutan yang berisi 0,3 g crude enzim papain yang telah dilarutkan dalam 10 mL buffer phosfat pH 7 dan diaduk. Dicampurkan larutan Kappa karaginan kedalam larutan kitosan-crude enzim papain dan dibiarkan dingin pada suhu kamar, kemudian ditambahkan 10 ml KCl 0,3M dan disimpan pada suhu 10^oC selama 1 malam, dipotong-potong dengan ukuran 5x5x5 mm dan dicuci dengan akuaes. Kemudian larutannya diuji dengan metode Biuret.

3.3.8. Penetuan Kadar Crude Enzim Papain Yang Tidak Terimobilisasi

Dipipet 1 mL larutan hasil pencucian crude enzim papain terimobil dan dimasukkan kedalam gelas beaker 100 mL dan ditambahkan akuades hingga volume total adalah 4 ml, ditambahkan 6 ml Pereaksi Biuret dan didiamkan selama 16 menit pada suhu kamar, dan diukur absorbansinya pada λmaks 549 nm.

3.3.9. Pengujian Suhu dan pH Optimum Aktivitas Crude Enzim Papain

3.4.9.1. Pengujian Suhu Optimum Aktivitas Crude Enzim Papain Bebas dan Terimobil

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam 6 buah gelas beaker 100 mL dan ditambahkan masing-masing 1 mL crude enzim papain 1% dan ditambahkan masing 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi masing-masing gelas beaker dengan variasi suhu 45,50,55,60,65,70^oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan masing-masing 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali masing-masing gelas beaker dengan variasi suhu yang sama selama 20 menit dan disaring.Kemudian masing-masing filtratnya diukur absorbansinya pada λmaks 274 nm.

* Dilakukan perlakuan yang sama untuk crude enzim papain terimobil dengan kappa karagenan dengan mengganti 1 ml crude enzim papain 1% menjadi 1,22 g crude enzim papain terimobil dengan kappa karagenan

* Dilakukan perlakuan yang sama untuk crude enzim papain terimobil dengan kappa karagenan dan kitosan dengan mengganti 1 ml crude enzim papain 1% menjadi 2,0869 g crude enzim papain terimobil dengan kappa karagenan dan kitosan

3.3.9.2. Pengujian pH Optimum Aktivitas Crude Enzim Papain Bebas dan Terimobil

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan masing-masing kedalam 5 buah gelas beaker 100 mL dan ditambahkan masing-masing 1 mL crude enzim papain 1% dan ditambahkan masing-masing 16 mL buffer phosfat dengan variasi pH 6 ; 6,5 ; 7 ; 7,5 ;8 untuk masing-masing gelas beaker dan diinkubasi pada suhu 55^oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan masing-masing 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 55^oC selama 20 menit dan disaring. Kemudian masing-masing filtratnya diukur absorbansinya pada λmaks 274 nm.

3.3.10. Pengujian Aktivitas Crude Enzim Papain Bebas dan Terimobil Pada Suhu dan pH Optimumnya

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan kedalam gelas beaker 100 mL dan ditambahkan 1 mL crude enzim papain 1% dan ditambahkan 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi pada suhu 55^oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 55^oC selama 20 menit dan

disaring. Kemudian filtratnya diukur absorbansinya pada λmaks 274 nm.

3.3.11. Pengujian Stabilitas Crude Enzim Papain Terimobil Pada Pemakaian Berulang

3.3.11.1. Pengujian Stabilitas Crude Enzim Papain Terimobil Dengan Kappa karagenan Pada Pemakaian Berulang

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan kedalam gelas beaker 100 mL dan ditambahkan 1,22 g crude enzim papain terimobil dengan kappa karagenan dan ditambahkan 16 mL buffer phosfat pH 6,5 dan diinkubasi pada suhu 60^oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 60^oC selama 20 menit dan disaring. Kemudian filtratnya diukur

absorbansinya pada λmaks 274 nm. Kemudian dipisahkan crude enzim papain terimobil dari endapan protein dalam residu tadi dan dimasukkan dalam KCl 0,3M dan disimpan pada suhu 10^oC dan 25^oC. Kemudian crude enzim papain terimobil tersebut digunakan kembali untuk uji aktivitas yang ke-2,3,4, dan 5.

3.3.11.2. Pengujian Stabilitas Crude Enzim Papain Terimobil Dengan Kappa karagenan dan Kitosan Pada Pemakaian Berulang

Sebanyak 1 mL kasein 1% dimasukkan kedalam gelas beaker 100 mL dan ditambahkan 2,0869 g crude enzim papain terimobil dengan kappa karagenan dan kitosan dan ditambahkan 16 mL buffer phosfat pH 7 dan diinkubasi pada suhu 65^oC selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 2 mL asam trikloroasetat 30% dan diinkubasi kembali pada suhu 65^oC selama 20 menit dan disaring. Kemudian filtratnya

diukur absorbansinya pada λmaks 274 nm. Kemudian dipisahkan crude enzim papain terimobil dari endapan protein dalam residu tadi dan dimasukkan dalam KCl 0,3M dan disimpan pada suhu 10^oC dan 25^oC. Kemudian crude enzim papain terimobil tersebut digunakan kembali untuk uji aktivitas yang ke-2,3,4, dan 5 dengan selang waktu 1 hari.

Dalam dokumen Imobilisasi Crude Enzim Papain Yang Diisolasi Dari Getah Buah Pepaya (Carica papaya L) Dengan Menggunakan Kappa Karagenan Dan Kitosan Serta Pengujian Aktivitas Dan Stabilitasnya (Halaman 39-46)