BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan iler yang diperoleh dari daerah Saribudolok kabupaten Simalungun, Sumatera Utara. Daun tumbuhan iler dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan iler sebanyak 700 g.
3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Tumbuhan Iler
Serbuk daun tumbuhan iler diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Uji busa
2. Skrining fitokimia
3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.2.1. Uji Busa
Ekstrak metanol daun tumbuhan iler sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambah 10 ml akuades. Lalu dikocok–kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 5 menit. Ternyata busa didalam sampel tidak hilang ini yang membuktikan bahwa di dalam daun tumbuhan iler terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2. Skrining Fitokimia
Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun tumbuhan iler (Coleus atropurpureus Benth) maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut :
Prosedur :
- Dimasukkan 10 gram serbuk tumbuhan iler (Coleus atropurpureus Benth.) yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam erlenmeyer
- Ditambahkan metanol 100 ml - Didiamkan selama 1 malam - Disaring
- Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi
a. Tabung I : dengan HCl 5% menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan H2SO4(p) menghasilkan larutaan orange kekuningan c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda d. Tabung IV : dengan NaOH 10% menghasilkan larutan berwarna biru violet
3.3.2.3. Analisis Kromatografi lapis Tipis (KLT)
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak klorofom dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F254. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana : etil asetat (90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40) v/v, sehingga diperoleh perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat yang sesuai untuk kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan berdasarkan pada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Prosedur analisis kromatografi lapis tipis :
Kedalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu campuran n-heksana : etil asetat dengan campuran (90:10 ; 80:20 ; 70-30 ; 60:40) v/v. Kemudian ekstrak klorofom ditotolkan pada plat KLT. Lalu plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Noda terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet dan difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan bercak noda yang baik adalah perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat (70:30) v/v yang memberikan empat noda dengan harga Rf yaitu 0,6; 0,52; 0,48; dan 0,32.
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia dari Ekstrak daun tumbuhan iler
Serbuk daun tumbuhan iler ditimbang sebanyak 700 g, dimasukkan ke dalam bejana dan ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua sampel terendam oleh pelarut
dan dibiarkan selama 72 jam dan sesekali diaduk. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak berwarna hijau tua. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoida. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator pada suhu 600C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksana, sehingga terbentuk lapisan n-heksana dan lapisan metanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan kemudian dihidrolisa dengan HCl 6%. Kemudian disaring dan filtrat tersebut diekstraksi partisi dengan klorofom secara berulang-ulang. Ekstrak klorofom dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat klorofom sebanyak 2 gram
3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat klorofom daun tumbuhan iler yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100% dan campuran pelarut n-heksana : etil asetat (90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40)v/v.
Prosedur isolasi senyawa flavonoida dengan kromatografi kolom :
Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksan 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 2 g ekstrak klorofom daun tumbuhan iler ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak kolom, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana-etil asetat mulai dari (90:10)v/v; (80:20)v/v; (70:30)v/v; (60:40)v/v, secara perlahan–lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 10 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoida dan diuapkan pelarutnya.
3.3.5. Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi kromatografi kolom pada perbandingan (70:30)v/v dari fraksi 113-140 dilakukan pemurnian senyawa. dengan cara KLT preparatif
Prosedur;
Senyawa hasil isolasi dipreparatif dengan menggunakan KLT preparatif. Senyawa tersebut ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler ke plat preparatif pada batas bawah dengan jarak 2 cm, kemudian dimasukkan kedalam chamber untuk dielusi dengan menggunakan perbandingan campuran eluen n-heksana : etil asetat.. Dielusi ± 2 jam, kemudian dikeringkan plat dan dilihat kenaikan noda dibawah lampu UV dengan panjang gelombang lampu yang berbeda, dilakukan penggerusan dan diambil senyawa dengan jarak noda yang sama, dilakukan pelarutan dengan metanol, dan ditampung kembali senyawa murni tersebut.
3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat (70:30) v/v.
Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis :
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak n-heksana : etil asetat ke dalam bejana kromatografi , lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan dengan klorofom pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas atas, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan. Harga Rf yang dihasilkan adalah 0,4. Kemudian difikasasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5 % menghasilkan bercak berwarna hitam dan NaOH 10 % menghasilkan warna biru violet sehingga menunjukkan adanya senyawa flavonoida.
3.3.7. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI, Serpong-Tangerang. (Lampiran E)
3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis dengan Spektrofotometer FT-IR dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI, Serpong-Tangerang. (Lampiran G)
3.3.7.2. Analisis senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Analisis dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) dilakukan di Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Serpong-Tangerang dengan menggunakan klorofom sebagai pelarut. (Lampiran H)