ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN ILER (Coleus atropurpureus Benth.)
SKRIPSI
RONY MAGDALENA SARAGIH 060802047
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN ILER (Coleus atropurpureus Benth.)
SKRIPSI
Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains
RONY MAGDALENA SARAGIH 060802047
DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
PERSETUJUAN
JUDUL : ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI
TUMBUHAN ILER (Coleus athroporpureus Benth.)
Kategori : SKRIPSI
Nama Mahasiswa : RONY MAGDALENA SARAGIH
Nomor Induk Mahasiswa : 060802047
Program Studi : SARJANA (S1) KIMIA
Departemen : KIMIA
Fakultas : MATEMATIKA DAN ILMU
PENGETAHUAN ALAM (FMIPA) UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
Disetujui di
Medan, Mei 2011
Komisi Pembimbing :
Pembimbing 2 Pembimbing 1
Lamek Marpaung, M.Phil, Ph.D Sovia Lenny, S.Si, M.Si NIP: 1952 0828 1982 031001 NIP 1975 1018 2000 032001
Diketahui oleh
Departemen Kimia FMIPA USU Ketua,
PERNYATAAN
ISOLASI SENYAWA FLAVONOIDA DARI DAUN TUMBUHAN ILER (Coleus atropurpureus Benth.)
SKRIPSI
Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja Saya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.
Medan, Mei 2011
PENGHARGAAN
Segala Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas kasih dan Anugrah Nya yang begitu besar sehingga penulis mampu menyelesaikan skripsi ini dalam waktu yang telah ditetapkan.
ABSTRAK
ISOLATION OF FLAVONOID COMPOUNDS FROM LEAVES OF ILER PLANTS (Coleus atropurpureus Benth.)
ABSTRACT
DAFTAR ISI
Bab 2 Tinjauan Pustaka
2.1 Tumbuhan Iler 5
2.1.1 Morfologi Tumbuhan Iler 5
2.1.2 Sistematika Tumbuhan iler 6
2.1.3 Manfaat Tumbuhan Iler 6
2.1.4 Kandungan Kimia Tumbuhan Iler 7
2.2 Senyawa Flavonoida 7
2.2.1 Struktur Dasar Senyawa Flavonoida 9
2.2.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida 10
2.2.3 Biosintesis Awal Senyawa Flavonoida 16 2.2.4 Metoda Isolasi Senyawa Flavonoida 17
2.2.5 Sifat Kelarutan Flavonoida 17
2.3 Teknik Pemisahan 18
2.3.1 Ekstraksi 18
2.3.2 Kromatografi 19
2.3.2.1 Kromatografi Lapisan Tipis 20
2.3.2.2 Kromatografi Preparatif 22
2.3.2.3 Kromatografi Kolom 23
2.3.2.4 kromatografi Kertas 24
2.4 Teknik Spektroskopi 25 2.4.1 Spektrofotometri Ultraviolet (UV-Vissible) 26 2.4.2 Spektrofotometri Inframerah (FT-IR) 27 2.4.3 Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton(1H-NMR) 29
Bab 3 Bahan dan Metode Penelitian
3.1 Alat-alat 31
3.2 Bahan 32
3.3 Prosedur Penelitian 32
3.3.1 Penyediaan Sampel 32
3.3.2 Uji Pendahuluan Ekstrak Tumbuhan Iler 33
3.3.2.1 Uji Busa 33
3.3.2.2 Skrining Fitokimia 33
3.3.2.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis 34 3.3.3 Prosedur Untuk Memperoleh Seyawa Kimia dari Ekstrak
daun tumbuhan iler 34 3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom 35
3.3.5 Pemurnian 36
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) 36
3.3.7. Analisis Spektroskopi Kristal Hasil Isolasi 37 3.3.7.1 Uji Kristal Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri
Infra merah 37
3.3.7.2 Uji Kristal Hasil Isolasi dengan Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti (1H-NMR) 37
3.4 Bagan Penelitian
3.4.1 Bagan Skrining fitokimia 38
3.4.2 Bagan Penelitian 39
Bab 4 Hasil dan Pembahasan
4.1 Hasil Penelitian 40
4.2 Pembahasan 42
Bab 5 Kesimpulan dan Saran
5.1 Kesimpulan 45
5.2 Saran 45
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran A. Gambar Daun Tumbuhan iler (Coleus atropurpureus Benth.) 50 Lampiran B. Hasil Determinasi Daun Tumbuhan iler
(Coleus atropurpureus Benth.) 51 Lampiran C. Kromatografi Lapisan Tipis Ekstrak Kloroform Daun Tumbuhan
iler (Coleus atropurpureus Benth.) 52 Lampiran D1. Kromatografi Lapisan Tipis Senyawa Hasil Isolasi Melalui
Penampakan Noda dengan Pereaksi FeCl3 5% dan NaOH 10% 53 Lampiran D2. Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Hasil Isolasi Melalui metode 2
dimensi 54 Lampiran E. Spektrum Ultra violet- Visible Senyawa Hasil Isolasi 55 Lampiran F. Spektrum Ultra Violet-Vissible Beberapa Senyawa Flavonoida 56 Lampiran G. Spektrum Infra Merah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi 57 Lampiran H. Spektrum 1H– NMR Senyawa Hasil Isolasi 58 Lampiran I. Sepktrum Ekspansi 1H– NMR Senyawa Hasil Isolasi dari
pergeseran 4,8-7,8 ppm 59 Lampiran J. Sepktrum Ekspansi 1H– NMR Senyawa Hasil Isolasi dari
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR TABEL
ABSTRAK
ISOLATION OF FLAVONOID COMPOUNDS FROM LEAVES OF ILER PLANTS (Coleus atropurpureus Benth.)
ABSTRACT
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Senyawa flavonoida terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga, buah, dan biji. Kebanyakan flavonoida ini berada di dalam tumbuh-tumbuhan, kecuali alga. Namun ada juga flavonoida yang terdapat pada hewan, misalnya dalam kelenjar bau berang-berang dan sekresi lebah. Dalam sayap kupu-kupu dengan anggapan bahwa flavonoida berasal dari tumbuh-tumbuhan yang menjadi makanan hewan tersebut dan tidak dibiosintesis di dalam tubuh mereka. Penyebaran senyawa flavonoida tersebar pada tumbuhan jenis angiospermae, klorofita, fungi, briofita (Markham, 1988).
Salah satu dari tumbuhan berkhasiat ini adalah tumbuhan iler (Coleus atropurpureus Benth.). Secara tradisional daun tumbuhan iler digunakan untuk membantu menghilangkan rasa nyeri, sembelit, sakit perut, mempercepat pematangan bisul, pembunuh cacing, ambeien, diabetes melitus, wasir, demam dan radang telinga. Sedangkan akarnya dapat mengatasi perut mulas dan mencret. Penggunaannya untuk obat-obatan dilakukan dengan meminum air rebusan daun atau batang atau dengan menggiling daun tumbuhan iler sampai halus dan dicampur dengan air minum dan disaring kemudian air saringan tersebut kemudian diminum (Dalimartha, 2000).
Pengujian efek antiinflamasi berbagai ekstrak daun tumbuhan iler pada hewan tikus putih jantan, menunjukkan bahwa ekstrak yang mempunyai daya anti inflamasi terbaik adalah infus daun iler. Hasil penapisan fitokimia terhadap daun dan infusa daun iler menunjukkan adanya senyawa flavonoid, saponin dan polifenol (Amitjitresmu, 1995). Dilakukan juga uji daya antibakteri ekstrak daun iler terhadap bakteri Bacillus subtillis, Escherichia coli. Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus areus. Dari hasil penelitian aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa fraksi n-heksan dan etanol memberikan aktivitas antibakteri yang terbaik terhadap Escherichia coli (Siahaan, E. 1995).
Efek sedatif dari ekstrak kasar etanol dari tumbuhan iler terhadap mencit putih jantan (Mas musculus) dengan metode depresan, menunjukkan bahwa dengan penambahan ekstrak kasar daun iler dengan menginduksikan kedalam fenolbarbital sehingga dapat memperpanjang lama tidur dari fungsi fenolbarbital pada taraf 0,05-0,01 mg/g. Hasil pengujian terhadap fraksi-fraksi ekstrak daun iler terhadap fraksi etil asetat menunjukkan bahwa ekstrak tersebut dapat meningkatkan fungsi fenolbarbital dalam hewan mencit putih jantan (Mas musculus) dibandingkan fraksi n-heksana dan air (Budiman, 1996).
Ascaris suum secara in vitro menunjukkan bahwa tumbuhan iler dapat digunakan sebagai obat cacing (Intansari, 2008).
Dari uji pendahuluan yang peneliti lakukan, yaitu dengan uji skrining fitokimia dengan pereaksi H2SO4(p), FeCl3 5%, dan Mg-HCl, NaOH 10 % menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun tumbuhan iler mengandung senyawa flavonoida.
Dari uraian diatas dan berdasarkan literatur mengenai manfaat tumbuhan iler dan kandungan kimia yang terdapat pada tumbuhan iler, maka peneliti tertarik melakukan penelitian terhadap daun tumbuhan iler tersebut, khususnya mengenai senyawa flavonoida yang terkandung di dalamnya.
I.2. Permasalahan
Permasalahan dalam penelitian ini adalah bagaimana cara mengisolasi senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun tumbuhan iler
(
Coleus atropurpureus Benth.)I.3. Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengisolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan iler
(
Coleus atropurpureus Benth.)1.4. Manfaat Penelitian
I.5. Lokasi Penelitian
Daun tumbuhan iler diperoleh dari daerah seribudolok kabupaten Simalungun, Sumatera Utara. Penelitian dilakukan di laboratorium Kimia Organik Bahan Alam FMIPA USU. Analisis Spektrofotometri UV-Visible, Spektrofotometri Infra Merah (FT-IR), dan Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton (H-NMR), dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI, Serpong – Tangerang.
I.6. Metodologi Penelitian
Dalam penelitian ini, isolasi senyawa flavonoida dilakukan terhadap daun tumbuhan iler berupa serbuk halus yang kering sebanyak 700 gram. Tahap awal dilakukan uji skrining fitokimia untuk senyawa flavonoida, yaitu dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5%, NaOH 10%, Mg-HCl, dan H2SO4(p).
Tahap isolasi yang dilakukan : - Ekstraksi Maserasi - Ekstraksi Partisi
- Analisis Kromatografi Lapis Tipis - Analisis Kromatografi Kolom
- Analisis preparatif kromatografi lapis tipis - Analisis Kristal hasil isolasi
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Tumbuhan Iler
2.1.1. Morfologi Tumbuhan Iler
Tumbuhan iler tumbuh subur di daerah dataran rendah sampai ketinggian 1500 meter diatas permukaan laut dan merupakan tanaman semusim. Umumnya tumbuhan ini ditemukan di tempat lembab dan terbuka seperti pematang sawah, tepi jalan pedesaan di kebun-kebun sebagai tanaman liar atau tanaman obat.
2.1.2. Sistematika Tumbuhan Iler
Dari sistem sistematika (taksonomi), tumbuhan iler dapat diklasifikasikan sebagai berikut:
Speies : Coleus atropurpureus Benth.
Nama umum tumbuhan ini adalah iler. Tumbuhan ini dikenal masyarakat Indonesia dengan nama daerah yaitu: si gresing (batak), adang-adang (Palembang), miana, plado (sumbar), jawer kotok (sunda), iler, kentangan (jawa), ati-ati, saru-saru (bugis), majana (Madura) (Dalimartha, 2008).
2.1.3. Manfaat Tumbuhan iler
Tumbuhan iler bermanfaat untuk menyembuhkan hepatitis dan menurunkan demam, batuk dan influenza. Selain itu daun tumbuhan iler ini juga berkhasiat untuk penetralisir racun (antitoksik), menghambat pertumbuhan bakteri (antiseptik), mempercepat pematangan bisul, pembunuh cacing (vermisida), wasir, peluruh haid
(emenagog), membuyarkan gumpalan darah, gangguan pencernaan makanan (despepsi), radang paru, gigitan ular berbisa dan serangga (Dalimartha, 2008).
2.1.4. Kandungan Tumbuhan Iler
Herba tumbuhan iler yang memiliki sifat kimiawi harum, berasa agak pahit, dingin, memiliki kandungan kimia sebagai berikut: daun dan batang mengandung minyak atsiri, fenol, tannin, lemak, phytosterol, kalsium oksalat, dan peptik substances. Komposisi kandungan kimia yang bermanfaat antara lain juga alkaloid, etil salisilat, metal eugenol, timol karvakrol, mineral (Dalimartha, 2008).
2.2. Senyawa Flavonoida
Senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linier yang terdiri dari tiga atom karbon. Senyawa-senyawa flavonoida adalah senyawa 1,3 diaril propana, senyawa isoflavonoida adalah senyawa 1,2 diaril propana, sedangkan senyawa-senyawa neoflavonoida adalah 1,1 diaril propana.
Istilah flavonoida diberikan pada suatu golongan besar senyawa yang berasal dari kelompok senyawa yang paling umum, yaitu senyawa flavon; suatu jembatan oksigen terdapat diantara cincin A dalam kedudukan orto, dan atom karbon benzil yang terletak disebelah cincin B. Senyawa heterosoklik ini, pada tingkat oksidasi yang berbeda terdapat dalam kebanyakan tumbuhan. Flavon adalah bentuk yang mempunyai cincin C dengan tingkat oksidasi paling rendah dan dianggap sebagai struktur induk dalam nomenklatur kelompok senyawa-senyawa ini. Sifat struktur yaitu cincin A biasanya memiliki tiga gugus oksigen yang berselang seling. Sedangkan cincin B kebanyakan mempunyai gugus fungsional oksigen berkedudukan para dua oksigen, berkedudukan para atau meta terhadap C3 (Manitto, 1981).
ini dimodifikasi dengan menggunakan campuran segar larutan besi (III) klorida 1% masih tetap digunakan secara umum untuk mendeteksi senyawa fenol pada kromatografi kertas. Tetapi kebanyakan senyawa fenol (terutama senyawa flavonoida) dapat dideteksi pada kromatogram berdasarkan warnanya atau floresensinya dibawah lampu UV, warnanya akan diperkuat atau berubah bila diuapi ammonia. Pigmen fenolik berwarna dapat terlihat jadi dan mudah disimak selama proses isolasi dan pemurnian (Harbone, 1987).
Senyawa flavonoida terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga, buah, dan biji. Kebanyakan flavonoida ini berada di dalam tumbuh-tumbuhan, kecuali alga. Namun ada juga flavonoida yang terdapat pada hewan, misalnya dalam kelenjar bau berang-berang dan sekresi lebah. Dalam sayap kupu-kupu dengan anggapan bahwa flavonoida berasal dari tumbuh-tumbuhan yang menjadi makanan hewan tersebut dan tidak dibiosintesis di dalam tubuh mereka. Penyebaran senyawa flavonoida tersebar pada jenis tumbuhan angiospermae, klorofita, fungi, briofita (Markham, 1988).
Senyawa varian flavonoid saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama, yang memasukkan substrat dari alur sikimat atau alur ‘asetat-melanoat’, flavonoida pertama yang dihasilkan segera setelah kedua alur itu bertemu. Modifikasi flavonoid pengurangan hidroksilasi; metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida; isopreenilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida; metilenasi gugus orto- dihidroksil; dimerisasi (pembentukan bivlafonoida); pembentukan bisulfat; dan yang terpenting glikolisasi gugus hidroksil (pembentukan flavonida o-glikosida atau inti flavonoida pembentukan flavonoida C-glikosida) (Markham, 1988).
2.2.1. Struktur Dasar Senyawa Flavonoida
C C C
A B
Gambar 1. Kerangka dasar senyawa flavonoida
Cincin A adalah karakteristik phloroglusinol atau bentuk resorsinol tersubstitusi
Namun sering terhidroksilasi lebih lanjut :
Cincin B adalah karakteristik 4-, 3, 4-, 3, 4, 5- terhidroksilasi
2.2.2. Klasifikasi Senyawa Flavonoida
Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak, umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida (Harborne, 1996).
Pada flavonoida O-glikosida, senyawa tersebut memiliki satu gugus hidroksil flavonoida (atau lebih) terikat pada satu gula (atau lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tidak tahan asam. Pengaruh glikosilasi menyebabkan flavonoida menjadi kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air. Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang sering juga terdapat adalah galaktosa, ramnosa, silosa, arabinosa, dan rutinosa. Adakalanya glikosida mengalami modifikasi lebih lanjut yaitu asilasi yang mempunyai satu gugus hidroksil gula atau lebih yang berikatan dengan asam seperti asam asetat. Waktu yang diperlukan untuk memutuskan suatu gula dari suatu flavonoida O-glukosida dengan hidrolisis asam ditentukan oleh sifat gula tersebut.
Pada flavonoida C-glikosida, senyawa tersebut memiliki gula yang terikat pada atom karbon flavonoida dan dalam hal ini gula tersebut terikat langsung pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon-karbon yang tahan asam. Gula yang terikat pada atom C hanya ditemukan pada atom C nomor 6 dan 8 dalam inti flavonoida. Biasanya jenis gula yang terikat paling umum misalnya viteksin, orientin, dan juga galaktosa misalnya ramnosa, xilosa.
Pada golongan flavonoida yang mudah larut dalam air yang ditemukan hanya diflavonoida sulfat. Senyawa ini mengandung satu ion sulfat, atau lebih, yang terikat pada hidroksil fenol atau gula. Hanya terbatas pada angioepermae (Markham, 1988).
tumbuhan yang secara umum berwarna merah dan jarang dijumpai berwarna biru pada suatu bunga. Khalkon termasuk butein, dengan cincin furan ditemukan dalam senyawa flavonoid. Auron merupakan pegmen berwarna kuning emas yang secara umum dijumpai pada bunga. Isoflavon dapat mengalami degredasi dengan adanya penambahan basa sehingga menghasilkan asam formiat dan deoxybenzoin, kemudian deoxybenzoin terpisah mengalami fusi (penggabungan dua inti ringan menjadi inti yang lebih berat molekulnya) basa dan metilasi. Isoflavon banyak digunakan sebagai estrogenik, insektidal, dan sebagai anti jamur (Raphael, 1991).
Menurut Robinson (1995), flavonoida dapat dikelompokkan berdasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu :
1. Flavonol
Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida, dan aglikon flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin, dan mirisetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiimflamasi. Flavonol lain yang terdapat di alam bebas kebanyakan merupakan variasi struktur sederhana dari flavonol. Larutan flavonol dalam suasana basa dioksidasi oleh udara tetapi tidak begitu cepat sehingga penggunaan basa pada pengerjaannya masih dapat dilakukan.
O
OH O
Struktur flavonol 2. Flavon
melalui ikatan karbon-karbon. Contohnya luteolin 8-C-glikosida. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa flavonoida.
Isoflavon merupakan isomer flavon, tetapi jumlahnya sangat sedikit dan sebagai fitoaleksin yaitu senyawa pelindung yang terbentuk dalam tumbuhan sebagai pertahanan terhadap serangan penyakit. Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi warna manapun. Beberapa isoflavon (misalnya daidzein) memberikan warna biru muda cemerlang dengan sinar UV bila diuapi amonia, tetapi kebanyakan yang lain tampak sebagai bercak lembayung yang pudar dengan amonia berubah menjadi coklat.
O
O
Struktur Isoflavon
4. Flavanon
Flavanon terdistribusi luas di alam. Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga. Flavanon glikosida merupakan konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk ; dua glikosida yang paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.
O
O
5. Flavanonol
Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika dibandingkan dengan flavonoida lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.
O
O
OH
Struktur Flavanonol 6. Katekin
Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu. Senyawa ini mudah diperoleh dalam jumlah besar dari ekstrak kental Uncaria gambir dan daun teh kering yang mengandung kira-kira 30% senyawa ini. Katekin berkhasiat sebagai antioksidan.
Leukoantosianidin merupakan senyawa tan warna, terutama terdapat pada tumbuhan berkayu. Senyawa ini jarang terdapat sebagai glikosida, contohnya melaksidin, apiferol.
semua warna merah jambu, merah marak , ungu, dan biru dalam daun, bunga, dan buah pada tumbuhan tinggi. Secara kimia semua antosianin merupakan turunan suatu struktur aromatik tunggal yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari pigmen sianidin ini dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil atau dengan metilasi atau glikosilasi.
O
OH
Struktur Antosianin 9.Khalkon
Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat kuat dengan sinar UV bila dikromatografi kertas. Aglikon flavon dapat dibedakan dari glikosidanya, karena hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas dalam pengembang air. (Harborne, 1996)
O
Struktur Khalkon 10. Auron
Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita. Dalam larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromatografi kertas berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet warna kuning kuat berubah menjadi merah jingga bila diberi uap amonia. (Robinson, 1995)
HC O
O
Struktur Auron
Tabel 1. Golongan-golongan Flavonoida menurut Harbone
Golongan flavonoida Penyebaran Ciri khas
Antosianin marak, dan biru juga dalam daun dan jaringan
tanwarna; terbatas pada gimnospermae.
pigmen bunga kuning, kadang-kadang terdapat juga dalam jaringan lain
tanwarna; dalam daun dan buah terutama dalam Citrus tanwarna; sering kali dalam akar; hanya terdapat dalam satu suku, Leguminosae
larut dalam air, λmaks 515-545 nm, bergerak dengan BAA pada
kertas. menghasilkan antosianidin (warna
diekstraksi dengan amil alkohol) bila jaringan dipanaskan dalam HCl 2M selama setengah jam. setelah hidrolisis, berupa bercak kuning murup pada kromatogram Forestal bila disinari dengan sinar UV; maksimal spektrum pada 330 – 350 melalui ikatan C-C; bergerak dengan pengembang air, tidak seperti flavon biasa.
pada kromatogram BAA berupa bercak redup dengan RF tinggi . dengan amonia berwarna merah ;maksimal spektrum 370-410 nm.
2.2.3. Biosintesis Awal flavonoid
Semua varian flavonoid saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama, yang memasukkan prazat dari alur sikimat dan alur asetat-melanoat, flavonoid pertama dihasilkan segera setelah alur itu bertemu. Sekarang flavonoid yang dianggap pertama kali terbentuk pada biosintesis adalah khalkon. Modifikasi flavonoid lebih lanjut terjadi pada berbagai tahap dan menghasilkan : penambahan atau pengurangan hidroksilasi, metilasi gugs hidroksil atau inti flavonoid, dimerisasi dan glikolisasi gugus hidroksil.
2.2.4. Metoda isolasi senyawa flavonoida
Metoda Isolasi Senyawa Flavonoida oleh Harborne dilakukan dengan cara sebagai berikut : daun yang segar dimaserasi dengan MeOH, lalu disaring. Ekstrak MeOH dipekatkan dengan rotari evaporator. Lalu ekstrak pekat yang dihasilkan, diasamkan dengan H2SO4 2M, didiamkan, lalu diesktraksi dengan Kloroform. Lapisan Kloroform diambil, lalu diuapkan, sehingga dihasilkan ekstrak polar pertengahan (Terpenoida atau senyawa Fenol) (Harborne, 1996).
2.2.5. Sifat kelarutan flavonoida
Aglikon flavonoida adalah polifenol sehingga mempunyai sifat kimia senyawa fenol, yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Tetapi harus diingat, bila dibiarkan dalam larutan basa, dan disamping itu terdapat oksigen, banyak yang akan terurai. Karena mempunyai sejumlah gugus hidroksil, atau suatu gula, flavonoida merupakan senyawa polar, maka umumnya flavonoida cukup larut dalam pelarut polar seperti, Metanol (MeOH), Etanol (EtOH), Butanol (BuOH), Aseton, Dimetilsulfoksida (DMSO), Dimetilformamida (DMF), Air dan lain-lain.
Adanya gula yang terikat pada flavonoida cenderung menyebabkan flavonoida lebih mudah larut dalam air sehingga campuran pelarut yang disebut diatas dengan air merupakan pelarut yang lebih baik untuk glikosida. Sebaliknya, aglikon yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, flavon dan flavonol yang termetoksilasi cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti Eter dan Kloroform (Markham, 1988).
2.3. Teknik Pemisahan
Ada 2 jenis teknik pemisahan:
1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan.
2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam suatu golongan (Muldja, 1995).
2.3.1. Ekstraksi
Ekstraksi dapat dilakukan dengan metode maserasi, perkolasi, dan sokletasi. Sebelum ekstraksi dilakukan, biasanya serbuk tumbuhan dikeringkan lalu dihaluskan dengan derajat kehalusan tertentu, kemudian diekstraksi dengan salah satu cara di atas. Ekstraksi dengan metode sokletasi dapat dilakukan secara bertingkat dengan berbagai pelarut berdasarkan kepolarannya, misalnya: n-heksan, eter, benzene, kloroform, etil asetat, etanol, metanol, dan air. Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan ekstrak yang terakhir memberikan reaksi negatif terhadap pereaksi flavonoida. Untuk mendapatkan larutan ekstrak yang pekat biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator (Harborne, 1987).
2.3.2. Kromatografi
Penjelasan tentang kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael Tswett, yang mengumumkan pemberian pemisahan klorofil dan pigmen lainnya dalam suatu seri tanaman. Sekarang kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fase.
Kromatografi merupakan suatu cara pemisahan fisik dengan unsur-unsur yang akan dipisahkan terdistribusikan antara dua fasa, satu dari fasa-fasa ini membentuk lapisan stasioner dengan luas permukaan yang besar dan fasa lainnya merupakan cairan yang merembes lewat. Fasa stasioner mungkin suatu zat padat atau suatu cairan dan fasa yang bergerak mungkin suatu cairan atau suatu gas (Underwood, 1981).
Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan mempertimbangkan beberapa sifat fisika umum dari molekul. Sifat utama yang terlibat ialah:
- Kecenderungan molekul untuk melarut dalam cairan (kelarutan)
- Kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan serbuk halus (adsorbs, penjerapan)
- Kecenderungan molekul untuk menguap atau berubah ke keadaan uap (keatsirian)
Pada sistem kromatografi, campuran yang akan dipisahkan ditempatkan dalam keadaan demikian rupa sehingga komponen-komponennya harus menunjukkan dua dari ketiga sifat tersebut. Hal ini melibatkan dua sifat berlainan, misalnya penjerapan dan kelarutan, misalnya kelarutan di dalam dua cairan yang tidak bercampur.
dimasukkan linarut ke dalam labu yang berisi cairan dan serbuk bahan padat (misalnya arang), linarut akan terdistribusi di antara permukaan bahan padat (dalam hal kedua ini, linarut menunjukkan sifat kejerapannya). Pada akhirnya dimasukkan linarut ke dalam labu yang sedikit mengandung cairan yang tidak atsiri, linarut akan menunjukkan sifat kelarutan dan keatsirian. Dalam sistem kromatografi, mungkin saja dapat memperbesar perbedaan itu, walaupun perbedaan itu sangat kecil, dan menjadikannya sebagai dasar pemisahan (Gritter, 1991).
Cara-cara kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat–sifat dari fasa diam, yang dapat berupa zat padat atau zat cair. Jika fasa diam berupa zat padat disebut kromatografi serapan, jika berupa zat cair disebut kromatografi partisi. Karena fasa gerak dapat berupa zat cair atau gas maka ada empat macam sistem kromatografi yaitu:
1. Fasa gerak cair–fasa diam padat (kromatografi serapan): a.kromatografi lapis tipis
b.kromatografi penukar ion
2. Fasa gerak gas–fasa diam padat, yakni kromatografi gas padat
3. Fasa gerak cair–fasa diam cair (kromatografi partisi), yakni kromatografi kertas. 4. Fasa gerak gas–fasa diam zat cair, yakni :
a. kromatografi gas–cair b. kromatografi kolom kapiler
Semua pemisahan dengan kromatografi tergantung pada kenyataan bahwa senyawa – senyawa yang dipisahkan terdistribusi diantara fasa gerak dan fasa diam dalam perbandingan yang sangat berbeda – beda dari satu senyawa terhadap senyawa yang lain (Sastrohamidjojo, 1991).
2.3.2.1. Kromatografi lapis tipis
bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan. Biasanya yang sering digunakan sebagai materi pelapisnya adalah silika gel. Tetapi dapat juga dipakai alumina (alumina oksida), kieselgur (diatomeus earth) dan selulosa. Pemilihan sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang akan digunakan (Khopkar, S.M., 2003).
Kromatografi Lapis Tipis pada plat berlapis yang berukuran lebih besar, biasanya 5x20 cm, 10x20 cm, atau 20x20 cm. Tebal lapisan adsorben dapat bervariasi tergantung penggunaannya. Larutan campuran senyawa yang akan dipisahkan diteteskan kira-kira 1,5 cm dari bagian bawah plat dengan menggunkan pipet mikro atau syringe. Zat pelarut yang terdapat pada sampel yang diteteskan kemudian diupakan terlebih dahulu. Selanjutnya plat kromatografi dikembangkan dengan mencelupkan pada chamber yang berisi campuran zat pelarut. Pengembangan tersebut masing-masing komponen senyawa dalam sampel, akan bergerak keatas dengan kecepatan yang berbeda yang diakibatkan oleh pengaruh proses pemilihan adsorben sampai identifikasi masing-masing komponen yang terpisah (Hosttetman, 1995).
Menurut Markham, Kromatografi Lapis Tipis terutama berguna untuk tujuan berikut:
1. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom
2. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom 3. Identifikasi flavonoida secara ko-kromatografi.
4. Menyegi arah atau perkembangan reaksi seperti hidrolisis ata metilasi 5. Isolasi flavonoida murni skala kecil
6. Penyerap dan pengembang yang digunakan umumnya sama dengan penyerap dan pengembang pada kromatografi kolom dan kromatografi kertas
(Markham, 1988).
2.3.2.2. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Metode kromatografi juga dapat dilakukan dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif yaitu pemisahan yang terdiri atas sejumlah senyawa serupa dengan kromatografi jenis yang sukar dan kadang-kadang lama dipisakan. KLT preparatif adalah cara ideal untuk memisahkan cuplikan kecil (50 mg sampai 1 g). Penjerap yang dipakai adalah silika gel dan dipakai untuk pemisaha campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil.Ketebalan adsorben yang paling sering dipakai 0,5-2 mm. Ukuran plat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm
2.3.2.3. Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran di bagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair. Ukuran kolom tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Pemisahan tergantung kepada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antar muka di antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fase bergeraknya (Yazid, E., 2005).
Kromatografi cair yang dilakukan dalam kolom besar merupakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan dalam jumlah besar (lebih dari 1 g). Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, dan tabung plastik. Pelarut atau fasa gerak dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita senyawa linarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari atas kolom (Gritter, 1991).
Dengan menggunakan cara ini, skala isolasi flavonoida dapat ditingkatkan hampir ke skala industri. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoida (berupa larutan) diatas kolom yang berisi serbuk penyerap (seperti selulose, silika, atau poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen menggunakan pelarut yang cocok. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujung. Menempatkan larutan cuplikan pada kolom sedemikian rupa sehingga terbentuk pita yang siap dielusi lebih lanjut (Markham, 1988).
partikelnya dibiarkan mengendap. Pengisian kolom yang tidak seragam dapat menghasilkan rongga-rongga ditengah-tengah kolom. Pada bagian bawah dan atas dari isian kolom diberi wool untuk menyangga isian. Bila kolom telah diisi bahan isian permukaan cairan tidak boleh dibiarkan turun dibawah permukaan bahan isian bagian atas, karena akan memberikan peluang masuknya gelembung-gelembung udara masuk kedalam kolom ( Hosttetman, 1995).
2.3.2.4. Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas pertama sekali dikembangkan di pertengahan abad ke 19 dan kemudian digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Meskipun dalam beberapa tahun metode pemisahan ini digantikan dengan teknik kromatografi lapisan tipis. Fase gerak dalam kromatografi kertas terdiri dari selulosa. Mekanisme terhadap pemisahan melibatkan penyerapan pada zat terlarut pada selulosa dan pemisahan pada zat terlarut antara fase oganik bergerak dan air dalam kertas. (Landgrebe, 1982).
2.3.3.5. Harga Rf (Reterdation Factor)
Mengidentifikasi noda-noda dalam lapisan tipis lazim menggunakan harga Rf yang diidentifikasikan sebagai perbandingan antara jarak perambatan suatu zat dengan jarak perambatan pelarut yang dihitung dari titik penotolan pelarut zat. Jarak yang ditempuh oleh tiap bercak dari titik penotolan diukur dari pusat bercak. Untuk mengidentifikasi suatu senyawa, maka harga Rf senyawa tersebut dapat dibandingkan dengan harga Rf senyawa pembanding.
Jarak perambatan bercak dari titik penotolan Rf =
Jarak perambatan pelarut dari titik penotolan
Faktor-faktor yang mempengaruhi gerakan noda dalam kromatografi lapis tipis yang juga mempengauhi harga Rf :
1. Struktur kimia dari senyawa yang dipisahkan 2. Sifat dari penyerap dan derajat aktivasi 3. Tebal kerataan dari lapisan penyerap 4. Pelarut dan derajat kemurnian fase gerak 5. Derajat kejenuhan dari uap
6. Jumlah cuplikan yang digunakan 7. Suhu
8. Kesetimbangan
9. Teknik percobaan ( Sastrohamidjojo, 1985)
2.4. Teknik Spektroskopi
Teknik spektroskopi adalah salah satu teknik analisis kimia–fisika yang mengamati tentang interaksi atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik. Ada dua macam instrumen pada teknik spektroskopi yaitu spektrometer dan spektrofotometer. Instrumen yang memakai monokromator celah tetap pada bidang fokus disebut sebagai spektrometer. Apabila spektrometer tersebut dilengkapi dengan detektor yang bersifat fotoelektrik maka disebut spektrofotometer (Muldja, 1955).
Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan tipe – tipe dari adanya gugus fungsi dalam satu molekul dan Resonansi Magnetik Inti yang memberikan informasi tentang bilangan dari setiap tipe dari atom hidrogen dan juga memberikan informasi yang menyatakan tentang lingkungan dari setiap tipe dari atom hidrogen. Kombinasinya dan data yang ada kadang–kadang menentukan struktur yang lengkap dari molekul yang tidak diketahui (Pavia, 1979).
2.4.1. Spektrometri Ultra violet
Serapan molekul di dalam derah ultra violet dan terlihat dari spektrum bergantung pada struktur ultra elektronik dari molekul. Penyerapan sejumlah energi, menghasilkan percepatan dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi lebih tinggi di dalam keadaan tereskitasi. Dalam prakteknya spektometri ultraviolet utnuk sebagian besar dibatasi oleh sistem terkonjugasi. Suatu spetrum ultraviolet diperoleh secara langsung dari suatu alat sederhana memetakan panjang gelombang dari suatu serapan terhadap intesitas serapan (Silverstain, 1984).
kedudukan pita I pada spektrum khalkon, auron dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi.
Tabel 2. Rentangan serapan spektrum UV-Visibel golongan flavonoida Pita II (nm) Pita I (nm) Jenis flavonoida
2.4.2. Spektrofotometri infra merah (FT-IR)
Bila sinar inframerah dilewatkan melalui cuplikan senyawa organik, maka sejumlah frekuensi diserap sedangkan frekuensi yang lain diteruskan atau ditransmisikan tanpa diserap. Ikatan-ikatan yang berbeda (C-C, C=C,C-O, C=O, O-H, N-H) mempunyai frekuensi vibrasi yang berbeda dan kita dapat mendeteksi danya ikatan tersebut dalam molekul organik dengan mengidentifikasi frekuensi-frekuensi karakteristiknya sebagai pita serapan dalam spektrum inframerah. (Noerdin, D. 1985)
Untuk menafsirkan sebuah spektrum infra-merah tidak terdapat aturan yang pasti. Akan tetapi, terdapat beberapa syarat yang harus dipenuhi sebelum mencoba menafsirkan sebuah spektrum yaitu:
a. Spektrum haruslah cukup terpisah dan mempunyai kuat puncak yang memadai.
b. Spektrum harus dibuat dari senyawa yang cukup murni.
c. Spektrofotometer harus dikalibrasi sehingga pita akan teramati pada panjang gelombang yang semestinya.
d. Metode penanganan cuplikan harus ditentukan.
Jika menggunakan pelarut, maka macam dan konsentrasi pelarut serta tebal sel harus disebutkan juga (Silverstein, 1986).
Vibrasi molekul dapat dibagi dalam dua golongan, yaitu vibrasi regang dan vibrasi lentur.
1. Vibrasi regang
Di sini terjadi terus menerus perubahan jarak antara dua atom di didalam suatu molekul. Vibrasi regang ini ada dua macam yaitu vibrasi regang simetris dan tak simetri.
2.Vibrasi lentur
Di sini terjadi perubahan sudut antara dua ikatan kimia. Ada empat macam vibrasi lentur yaitu vibrasi lentur dalam bidang yang dapat berupa vibrasi scissoring atau vibrasi rocking dan vibrasi keluar bidang yang dapat berupa waging atau berupa twisting (Noerdin, 1985).
2.4.3. Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Spektrometri Resonansi Magnetik Inti (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) merupakan alat yang berguna pada penentuan struktur molekul organik. Teknik ini memberikan informasi mengenai berbagai jenis atom hidrogen dalam molekul.. Struktur NMR memberikan informasi mengenai lingkungan kimia atom hidrogen, jumlah atom hidrogen dalam setiap lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap atom hidroge (Cresswell, 1982).
Senyawa yang paling lazim dan paling berguna dipakai sebagai acuan adalah tetrametilsilana (TMS). Beberapa keuntungan dari pemakaian standar internal TMS yaitu :
1. TMS mempunyai 12 proton yang setara sehingga akan memberikan spektrum puncak tunggal yang kuat.
CH3
CH3 Si CH3
CH3
2. TMS merupakan cairan yang mudah menguap, dapat ditambahkan kedalam larutan sampel dalam pelarut CDCl3 atau CCl4. (Silverstein, 1986)
BAB 3
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1. Alat-Alat
1. Kolom Kromatografi
2. Neraca analitis Mettler PM 480
3. Rotari evaporator Buchi B-480
4. Labu alas 500 ml Pyrex
22.Spektrofotometer UV
23.Spektrometer 1H-NMR Delta2_NMR
3.2. Bahan
1. Daun tumbuhan iler (Coleus atropurpureus Benth)
2. Etil asetat Teknis
3. Kloroform p.a Merck
4. Metanol Destilasi
5. HCl 6%
6. Plat KLT Silika gel 60 F254 untuk plat E.Merck.Art 554 7. Plat KLT Preparatif
8. N-heksana Teknis
9. FeCl3 5 % 10.H2SO4(p) 11.NaOH 10% 12.Mg-HCl 13.Akuades
14.Silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM E.Merck. KGaA
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyediaan Sampel
3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Tumbuhan Iler
Serbuk daun tumbuhan iler diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Uji busa
2. Skrining fitokimia
3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
3.3.2.1. Uji Busa
Ekstrak metanol daun tumbuhan iler sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambah 10 ml akuades. Lalu dikocok–kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 5 menit. Ternyata busa didalam sampel tidak hilang ini yang membuktikan bahwa di dalam daun tumbuhan iler terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2. Skrining Fitokimia
Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun tumbuhan iler (Coleus atropurpureus Benth) maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut :
Prosedur :
- Dimasukkan 10 gram serbuk tumbuhan iler (Coleus atropurpureus Benth.) yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam erlenmeyer
- Ditambahkan metanol 100 ml - Didiamkan selama 1 malam - Disaring
a. Tabung I : dengan HCl 5% menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan H2SO4(p) menghasilkan larutaan orange kekuningan c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda d. Tabung IV : dengan NaOH 10% menghasilkan larutan berwarna biru violet
3.3.2.3. Analisis Kromatografi lapis Tipis (KLT)
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak klorofom dengan menggunakan fasa diam silika gel 60F254. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana : etil asetat (90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40) v/v, sehingga diperoleh perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat yang sesuai untuk kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan berdasarkan pada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Prosedur analisis kromatografi lapis tipis :
Kedalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu campuran n-heksana : etil asetat dengan campuran (90:10 ; 80:20 ; 70-30 ; 60:40) v/v. Kemudian ekstrak klorofom ditotolkan pada plat KLT. Lalu plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Noda terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet dan difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan bercak noda yang baik adalah perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat (70:30) v/v yang memberikan empat noda dengan harga Rf yaitu 0,6; 0,52; 0,48; dan 0,32.
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia dari Ekstrak daun tumbuhan iler
dan dibiarkan selama 72 jam dan sesekali diaduk. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak berwarna hijau tua. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoida. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator pada suhu 600C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksana, sehingga terbentuk lapisan n-heksana dan lapisan metanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan kemudian dihidrolisa dengan HCl 6%. Kemudian disaring dan filtrat tersebut diekstraksi partisi dengan klorofom secara berulang-ulang. Ekstrak klorofom dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat klorofom sebanyak 2 gram
3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat klorofom daun tumbuhan iler yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100% dan campuran pelarut n-heksana : etil asetat (90 : 10 ; 80 : 20 ; 70 : 30 ; 60 : 40)v/v.
Prosedur isolasi senyawa flavonoida dengan kromatografi kolom :
3.3.5. Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi kromatografi kolom pada perbandingan (70:30)v/v dari fraksi 113-140 dilakukan pemurnian senyawa. dengan cara KLT preparatif
Prosedur;
Senyawa hasil isolasi dipreparatif dengan menggunakan KLT preparatif. Senyawa tersebut ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler ke plat preparatif pada batas bawah dengan jarak 2 cm, kemudian dimasukkan kedalam chamber untuk dielusi dengan menggunakan perbandingan campuran eluen n-heksana : etil asetat.. Dielusi ± 2 jam, kemudian dikeringkan plat dan dilihat kenaikan noda dibawah lampu UV dengan panjang gelombang lampu yang berbeda, dilakukan penggerusan dan diambil senyawa dengan jarak noda yang sama, dilakukan pelarutan dengan metanol, dan ditampung kembali senyawa murni tersebut.
3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat (70:30) v/v.
Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis :
3.3.7. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI, Serpong-Tangerang. (Lampiran E)
3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis dengan Spektrofotometer FT-IR dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI, Serpong-Tangerang. (Lampiran G)
3.3.7.2. Analisis senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
3.4. Bagan Skrining Fitokimia
diekstraksi maserasi dengan metanol
disaring
ditambahkan ditambahkan ditambahkan ditambahkan
pereaksi FeCl3 pereaksi NaOH pereaksi pereaksi 5% 10% Mg-HCl H2SO4(p)
warna
Larutan
biru violet
Larutan merah muda
Larutan orange kekuningan Larutan
hitam
BAGAN PENELITIAN ( Coleus atropurpureus Benth )
Residu Ekstrak klorofom
Ektrak pekat klorofom
Lapisan metanol-asam
Hasil positif
Fraksi 117-127 Fraksi 128-157 Fraksi 168-175 Fraksi 101-116
Hasil positif Hasil positif Hasil negatif
Senyawa murni
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak dari daun tumbuhan iler dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi warna untuk menentukan golongan senyawa kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoida yakni:
1. H2SO4(p) memberikan warna orange kekuningan 2. NaOH 10 % memberikan warna biru violet 3. FeCl3 5 % memberikan warna hitam 4. Mg–HCl memberikan warna merah muda
Hasil Isolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan iler (Coleus atropurpureus Benth.) diperoleh dengan menggunakan fase gerak n-heksana : etil asetat (70/30)v/v yang menghasilkan senyawa berwarna kuning kecoklatan berbentuk pasta sebanyak 16,6 mg.
Dari hasil analisis Spektrofotometer ultra violet visible (UV – Visible) memberikan panjang gelombang maksimum ( λ maks ) 253,5 nm (Lampiran E). .
Hasil analisis Spektrofotometer infra merah (FT-IR) dari senyawa hasil isolasi memberikan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang (cm-1) sebagai berikut (Lampiran G) :
2. Pada bilangan gelombang 2929,87 cm-1 – 2873,94 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur (stretching) C-H.
3. Pada bilangan gelombang 1707,00 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ikatan rangkap C=O dari keton
4. Pada bilangan gelombang yang terdapat pada daerah 1645,28 cm-1 – 1612,49 cm-1 puncak melebar menunjukkan adanya ikatan rangkap C=C dari sistem aromatik dan alifatik
5. Pada bilangan gelombang 1448,54 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi regang (bending) CH2
6. Pada bilangan gelombang 1371,39 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ulur (stretch) –CH3 (Pavia, 1979)
7. Pada bilangan gelombang 1259,52 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi OH pengibasan dan uluran C-O
8. Pada bilangan gelombang 1199,72 cm-1 - 1170,79 cm-1 puncak melebar menunjukkan adanya vibrasi ulur (stretch) dari C-O dan juga pada bilangan gelombang 1089,78 cm-1 - 1041,56 cm-1 menunjukkan adanya serapan vibrasi C-O-C simetrik
9. Pada bilangan gelombang 966,34 cm-1 dengan puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi C-H dari benzen
10.Pada bilangan gelombang 902,69 cm-1 puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi -C=CH dari cincin aromatik
11.Pada bilangan gelombang 680,87 cm-1 puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi –CH pada cincin aromatik.
Hasil analisis spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) memberikan pergeseran kimia pada daerah (ppm) sebagai berikut (Lampiran H) :
1. Pergeseran kimia pada daerah δ=6,5 ppm puncak singlet menunjukkan proton-proton yang terdapat pada cincin A yaitu pada H6 dan H8
2. Pergeseran kimia pada daerah δ=7,56 ppm dengan puncak singlet
menunjukkan proton pada H2 yang terdapat pada cincin C 3. Pergeseran kimia pada daerah δ= 6,94-6,95 ppm dengan puncak doublet
menunjukkan proton C-CH=CH-C pada posisi H2΄ dan H6΄ dari cincin B
4. Pergeseran kimia pada daerah δ= 7,67-7,68 ppm dengan puncak doublet menunjukkan proton C-CH=CH-C pada posisi H3΄ dan H5΄ dari cincin B
5. Pergeseran kimia pada daerah δ=9,5 ppm dan δ=10,0 ppm dengan puncak singlet menunjukkan proton pada OH yang letaknya belum dapat dipastikan dan pergeseran kimia pada daerah δ=13,01 ppm dengan puncak singlet menunjukkan proton –OH pada atom C5 cincin A pada struktur isoflavonoida ( Scutz, B.A, 1995).
4.2. Pembahasan
Dari hasil kromatografi lapis tipis, diketahui bahwa perbandingan pelarut yang baik untuk mengisolasi senyawa flavonoida dari daun tumuhan iler adalah n-heksana : etil asetat (70:30v/v) yang menunjukkan pemisahan yang lebih baik dari noda yang dihasilkan. Hal ini juga dibuktikan dengan analisis KLT yang menunjukkan hanya satu noda tunggal pada senyawa yang dihasilkan.
Berdasarkan spektrum UV-Visible dari senyawa flavonoida yang diisolasi, memberikan panjang gelombang maksimum ( λ maks ) 253,5 nm. Dengan pelarut metanol sedangkan dari literatur panjang gelombang maksimum 245-275 nm yaitu senyawa flavonoid dengan jenis isoflavonoida ( Markham, 1988)
Dari hasil interpretasi Spektrum Infra Merah dan spectrum Resonansi Magnetik Inti proton (1HNMR), senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut klorofom diperoleh sebagai berikut:
Hal ini didukung oleh spektrum inframerah pada bilangan gelombang 2929,87 cm-1–2873,94 cm-1 puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur (stretching) C-H. Didukung juga pada bilangan gelombang 1448,54 cm-1 dengan puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi regang (bending) CH2,. Bilangan gelombang 1371,39 cm-1 puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi ulur (stretch) –CH3.. Pada bilangan gelombang 966,34 cm-1 dengan puncak sedang menunjukkan adanya vibrasi C-H dari benzene. Didukung juga oleh adanya vibrasi –CH pada cincin aromatik dengan bilangan gelombang 680,87 cm-1 2. Pergeseran kimia pada daerah δ=7,6 ppm dengan puncak singlet menunjukkan
proton pada H2 yang terdapat pada cincin C. Hal ini didukung adanya vibrasi ulur (stretch) dari C-O pada bilangan
gelombang 1199,72 cm-1 - 1170,79 cm-1 dan juga pada bilangan gelombang 1089,78 cm-1 - 1041,56 cm-1 menunjukkan adanya serapan vibrasi C-O-C simetrik
3. Pergeseran kimia pada daerah δ= 6,94-6,95 ppm dengan puncak doublet menunjukkan proton C-HC=CH-C pada posisi H2΄dan H6΄ dari cincin B dan Pergeseran kimia pada daerah δ= 7,67-7,68 ppm dengan puncak doublet menunjukkan proton C-CH=CH-C pada posisi H3΄ dan H5΄ dari cincin B
Hal ini didukung oleh adanya spektrum inframerah pada bilangan gelombang 1645,28 cm-1 - 1612,49 cm-1 menunjukkan adanya ikatan rangkap C=C dari sistem aromatic. Pada bilangan gelombang 902,69 cm-1 puncak lemah menunjukkan adanya vibrasi -C=CH dari cincin aromatic.
Dari data spektrum UV-Visible, FT-IR, dan 1H-NMR dapat disimpulkan bahwa kemungkinan senyawa hasil isolasi adalah senyawa isoflavonoida dengan kerangka struktur sebagai berikut:
O
A C
B 1
2
3
4 5
6 7
8 9
10 1'
2' 3'
4'
5' 6'
OH O
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Dari hasil uji skrining fitokimia dengan pereaksi flavonoida menunjukkan bahwa Daun Tumbuhan Iler (Coleus atropurpureus Benth.) mengandung senyawa flavonoida. Isolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan iler (Coleus atropurpureus Benth.) yang diekstraksi dengan menggunakan pelarut klorofom menghasilkan pasta berwarna kuning kecoklatan sebanyak 16,6 mg
2. Dari data analisis spektrum UV-Vissible, spektroskopi Infra Merah (FT-IR) dan spektroskopi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi adalah senyawa golongan isoflavonoida
5.2 Saran
DAFTAR PUSTAKA
Amitjitraresmu, 1995. Uji Efek Anti Inflamasi Berbagai Ekstrak Daun Iler ( Coleus atropurpureus, Benth.) dan Penelusuran Senyawa aktifnya. FMIPA UNPAD.Bandung.
Bernasconi, G. 1995. Tegnologi Kimia. Jilid 2. Edisi Pertama. Pradaya Pratama. Jakarta.
Budiman, 1996. Ujian Efek Sedatif Dari Ekstrak Etil Asetat Tumbuhan Iler Dengan Metode Depresan. FMIPA UNPAD. Bandung.
Creswell, C.J. 1981. Oraganik Analisis Spektrum Senyawa. Edisi Kedua. Penerbit ITB. Bandung
Dalimartha, S. 1996. Ramuan Tradisional untuk Pengobatan. Lembaga Biologi Nasional-LIPI. Jakarta
Gritter, R.J. 1991. Pengantar Kromatografi. Terbitan Kedua. Terjemahan Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung
Harbone, J.B. 1987. Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisa Tumbuhan. Terbitan kedua. Terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwang
Soediro. Penerbit ITB. Bandung
Herbert, R.B. 1989. Biosintesis Metabolit Sekunder. Edisi Kedua. Cetakan Pertama. IKIP Press. Semarang
Hostettman, K. 1995. Cara Kromatografi Preparatif “Penggunaan pada Isolasi Senyawa Alam”.. Penerbit ITB. Bandung
Intansari, 1988. Uji Kromatografi Lapis Tipis dan Daya Anthelmentik Ekstrak Etanol 70% Daun Iler (Coleus Scutellarioides (L.) Benth) Terhadap Ascaris Suum Secara Invitro. Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta.
Khopkar, S.M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Terjemahan A. Saptorahardjo. UI-Press. Jakarta.
Landgrebe, J.A. 1982. Theory and Practice in the Organic Laboratory. Third Edition. D.C. Heath and Company. New York.
Ledina, L. 1995. Isolasi Senyawa Steroid Dari Ekstrak Metanol Tumbuhan Iler (Coleus atropurpureus Benth.). FMIPA USU. Medan
Mabry, T. J. and Markham, K. R. 1970. The Systematic Identification Of Flavonoids. Springer-Verlag. New York.
Manitto, P. 1992. Biosintesis Produk Alami. Cetakan Pertama. Terjemahan Koensoemardiyah. IKIP Press. Bandung.
Markham, K. R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoida. Terjemahan Kosasi. Padmawinata.: ITB Press. Bandung
Muldja, M.H. 1995. Analisis Instrumental. Cetakan Pertama. Universitas Airlangga Press. Surabaya
Noerdin, D. 1985. Elusidasi Struktur Senyawa Organik Dengan Cara Spektroskopi Ultralembayung dan Inframerah. Penerbit Angkasa. Bandung.
Pavia, L.D. 1970. Introduction to Spectrocopy a Guide for Students of Organic Chemistry. Sounders Collage. Philadelphia.
Salisbury, F.B. 1995. Fisiologi Tumbuhan. Edisi Keempat. Jilid Dua. Penerbit ITB. Bandung
Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Cetakan Pertama. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
Siahaan, Edward. 1995. Isolasi dan identifikasi senyawa aktif ekstrak daun iler (Coleus atropurpureus Benth). Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam UNPAD. Bandung
Silverstein, R.M. 1984. Penyidikan Spektrometrik Senyawa Organik. Terjemahan A.J. Hatomo dan Any Viktor Purba. Edisi Keempat. Pernerbit Erlangga. Jakarta. Schutz, B.A. 1995. PhytochemistryVolume 40. Departement Of Chemistry. Papua
New Guinea..
Tobing, R.L. 1989. Kimia Bahan Alam. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi. Proyek Pembangunan Lembaga Pendidikan Tenaga Kependidikan. Jakarta
Yazid, E. 2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Penerbit Andi. Yogyakarta.
Lampiran A. Gambar Daun Tumbuhan Iler (Coleus atropurpureus Benth)
Lampiran B. Hasil Determinasi Daun Tumbuhan Iler (Coleus atropurpureus
Lampiran C. Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak klorofom daun tumbuhan iler (Coleus atropurpureus Benth.) dengan penampakan noda dibawah
sinar ultraviolet dengan λ = 254 nm.
I II III IV
E E E E
Keterangan :
Fase diam : Silika gel 60 F254
E : Ekstrak klorofom daun tumbuhan iler I : Fase gerak n-heksana : etil asetat (90:10)v/v II : Fase gerak n-heksana : etil asetat (80:20)v/v III : Fase gerak n-heksana : etil asetat (70:30)v/v IV : Fase gerak n-heksana : etil asetat (60:40)v/v
No Fase gerak Jumlah
noda
Warna noda Rf
1 n-heksana : etil saetat (90:10)v/v - - -
2 n-heksana : etil saetat (80:20)v/v 1 Kuning kecoklatan 0,62 3 n-heksana : etil saetat (70:30)v/v 4 Kuning kecoklatan
Kuning kecoklatan 4 n-heksana : etil saetat (60:40)v/v 3 Kuning kecoklatan
Kuning kecoklatan Kuning kecoklatan
Lampiran D1. Kromatografi Lapis Tipis Senyawa Hasil Isolasi melalui penampakan noda dengan penambahan pereaksi
I II
S S
Keterangan :
Fase diam : Silika gel 60 F254 S : Senyawa hasil isolasi I : FeCl3 1% (warna hitam)
II : NaOH 10 % (warna biru violet)
Data harga Rf dari bercak noda :
No Penampakan bercak Pereaksi Warna noda Rf
1 I FeCl3 Hitam 0,4
Lampiran D2. Kromatografi Lapisan Tipis Senyawa Hasil Isolasi Melalui Metode 2 Dimensi
Dengan eluen n-heksana : etil asetat (70:30)v/v
Keterangan:
Fase diam : Kieselgel 60 GF (0,063-0,200 mm) E.Merck.Art.7734 Fase gerak : n-heksana : etil asetat (70:30)
