BAHAN DAN METODOLOGI PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyediaan sampel
Sampel yang diteliti adalah kulit buah mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq) yang diperoleh dari satu pohon mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq.) yang terletak di sekitar Laboratorium Dasar Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara. Kulit – kulit buah tersebut dihaluskan lalu dikeringkan di udara terbuka dalam suhu kamar sampai mengering sehingga diperoleh serbuk kulit buah mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq.) sebanyak 1000 g.
3.3.2. Uji Skrining Fitokimia
Dilakukan uji pendahuluan terhadap serbuk kulit buah mahoni (S. mahagoni (L.)
Jacq.) untuk mengetahui senyawa – senyawa fitokimia apa saja yang terdapat di
dalamnya dan memperkuat latar belakang isolasi senyawa terpenoida dalam kulit buah ini. Uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna.
Prosedur :
1. Serbuk kering kulit buah mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq.) diambil ± 10 g,
dimaserasi dengan metanol dan didiamkan selama ± 4 jam dalam suhu kamar lalu disaring dan diambil filtratnya. Ekstrak metanol yang diperoleh dibagi kedalam 2 tabung reaksi.
2. Kedua tabung reaksi tersebut ditambahkan masing-masing pereaksi:
Tabung I : dengan pereaksi CeSO4 1% dalam H2SO4 10%
menghasilkan larutan coklat. Hal ini menunjukkan positif terpenoida.
Tabung II : dengan pereaksi Salkowsky (H2SO4(p)) menghasilkan
larutan merah . Hal ini menunjukkan positif terpenoida.
3.3.3. Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Kulit Buah Mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq.)
Serbuk kulit buah mahoni (S. mahagoni (L.) Jacq) yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 1000 g kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak 12,5 L selama ± 15 hari, kemudian ditampung dan dipekatkan dengan rotavapor sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Ekstrak pekat metanol tersebut dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotavapor sehingga diperoleh ekstrak pekatlapisan metanol sebanyak 13 g.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis kromatografi lapis tipis dimaksudkan untuk mencari sistem fasa gerak (eluen) yang sesuai di dalam analisis kromatogafi kolom. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n – heksana : EtOAc dengan variasi perbandingan 90:10 v/v, 80:20 v/v, 70:30
v
/v, dan 60:40 v/v. Sedangkan fasa diamnya adalah silika gel Kieselgel 60 F254 Merck.
Prosedur :
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak 90:10 v/v dalam bejana kromatografi. Ditotolkan ekstrak pekat lapisan metanol pada pelat KLT yang telah diaktifkan. Pelat dimasukkan ke dalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi, pelat dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Noda yang terbentuk diamati dibawah sinar UV, kemudian dihitung harga Rf dan dicatat. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n- heksana : EtOAc selanjutnya (80:20 v/v, 70:30 v/v, dan 60:40 v/v).
Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam kulit buah mahoni (S.
mahagoni (L.) Jacq) terdapat senyawa terpenoida dan hasil pemisahan yang baik
diberikan pada fasa gerak n – heksana : EtOAc (70 : 30) v/v. (LAMPIRAN C)
3.3.5. Pemisahan Senyawa Terpenoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa terpenoida dengan kromatografi kolom menggunakan fasa diam silika gel 40 E. Merck dan fasa gerak n – heksana : EtOAc dengan perbandingan 90:10 v/v , 80:20 v/v ,70:30 v/v ,60:40 v/v, selanjutnya etil asetat 100%, dan terakhir metanol 100%.
Prosedur:
Dirangkai peralatan untuk kromatografi kolom, kemudian dibuburkan silika gel 40 E. Merck sebanyak 300 g dengan n - heksana, diaduk sampai homogen dan dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Lalu dielusi dengan n – heksana 100 % hingga bubur silika gel memadat dan homogen di dalam kolom. Selanjutnya dimasukkan 13 g ekstrak pekat lapisan metanol yang telah diperoleh sebelumnya dan
telah dibuburkan dengan silika gel E. Merck sebanyak 30 g. Sampel dielusi dengan n – heksana 100 %. Lalu ditambahkan fasa gerak n – heksana : EtOAc 90:10 v/v secara perlahan-lahan ke dalam kolom, diatur sehingga aliran fraksi keluar dari kolom kromatografi bergerak secara kontinu dan ditampung tiap fraksi dalam botol vial masing-masing sebanyak 12 ml. Dinaikkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n – heksana : EtOAc 80:20 v/v, 70:30 v/v, dan 60:40 v/v secara berturut – turut. Fraksi-fraksi dengan Rf yang sama digabungkan. Selanjutnya sisa komponen – komponen senyawa yang masih ada di dalam kolom, dielusi dengan etil asetat 100%, dan terakhir metanol 100%. Tiap –tiap fraksi yang ditampung selanjutnya dianalisis KLT menggunakan campuran pelarut n-heksana : etil asetat (70 : 30 v/v) dan diuji dengan CeSO4 1% dalam H2SO4 10%, lalu diuapkan hingga diperoleh senyawa hasil isolasi berbentuk amorf.
3.3.6. Pemisahan Senyawa Terpenoida dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Isolasi senyawa terpenoida dengan KLT preparatif dilakukan karena hasil analisis KLT dari amorf yang diperoleh dengan kromatografi kolom menunjukkan hasil yang belum murni.
Prosedur:
Amorf yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan Me-OH lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai untuk preparatif KLT. CHCl3 : EtOAc (70 : 30 v/v) adalah fasa gerak yang menunjukkan pemisahan paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Sedangkan amorf yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan – lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah pelat KLT yang telah diaktifkan. Pelat dimasukkan kedalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan, kemudian ditutup. Setelah dielusi, pelat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan hasilnya diperiksa di bawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan dikeruk lalu dielusi dengan metanol
100%. Hasil elusi diuapkan hingga diperoleh amorf. (Pemisahan dengan cara ini dilakukan tidak hanya pada amorf dari fraksi 1-115, tetapi juga dari fraksi EtOAc).
3.3.7. Pemurnian
Pemurnian bertujuan memisahkan amorf yang mengandung senyawa terpenoida dari pengotor – pengotor yang kemungkinan masih bercampur.
Prosedur :
Amorf yang diperoleh dari isolasi dengan KLT preparatif dilarutkan kembali dengan EtOAc, diaduk hingga semua amorf larut sempurna. Kemudian ditambahkan n – heksana secara perlahan – lahan hingga pembentukan kembali senyawa yang lebih murni dari sebelumnya dan jatuh di dasar wadah. Didekantasi larutan bagian atas wadah. Lalu diuapkan sisa pelarut dari amorf hingga diperoleh amorf yang benar – benar bebas dari pelarut.(Jacobs, 1974).
(Pemurnian dengan cara ini dilakukan tidak hanya pada amorf dari fraksi 1-115, tetapi juga dari fraksi EtOAc).
3.3.8. Analisis Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1. Uji Kemurnian Amorf dengan Kromatografi Lapis Tipis dan Uji Reaksi Warna dengan Pereaksi Terpenoida
Uji kemurnian amorf yang diperoleh dengan KLT menggunakan fasa diam Kieselgel 60 F 254 Merck dan fasa gerak CHCl3 : EtOAc ( 70 : 30 ) v/v.
Prosedur :
Diambil sedikit amorf yang diperoleh lalu dilarutkan dengan aseton (sekaligus untuk mengetahui kelarutan amorf pada aseton sehingga dapat digunakan sebagai pelarut pada spektroskopi), kemudian ditotolkan pada pelat KLT:
1. Larutan fasa gerak CHCl3 : EtOAc ( 70 : 30 ) v/v dimasukkan dalam bejana KLT. Pelat yang telah ditotolkan sampel dimasukkan kedalam bejana KLT dan dibiarkan hingga fase gerak naik sampai batas atas yang telah ditentukan. Selanjutnya pelat dikeluarkan dari bejana KLT, dikeringkan dan noda yang terlihat di bawah sinar UV berwarna coklat. Diberi tanda pada noda tersebut dan dihitung harga Rf.
2. Difiksasi noda pada pelat KLT tersebut dengan pereaksi CeSO4 1% dalam H2SO4
10%.
(LAMPIRAN E)
3.3.8.2. Penentuan Titik Lebur
Amorf hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam alat pengukur titik lebur, diatur suhu. Lalu diamati suhu sampai amorf melebur.
3.3.8.3. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.3.1. Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR)
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang.
(LAMPIRAN F)
3.3.8.3.2. Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Analisis alat Spektrometer 1H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian
Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan aseton sebagai pelarut.