BAHAN DAN METODOLOGI PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1.Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan senggani yang diperoleh dari daerah Dolok Sanggul, Kabupaten Humbang Hasundutan, Sumatera Utara. Daun tumbuhan senggani dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk sebanyak 1500 gram.
3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Senggani
Serbuk buah tumbuhan Senggani diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Uji Busa
2. Skrining Fitokimia
3.3.2.1.Uji Busa
Serbuk daun tumbuhan Senggani sebanyak 1500 g dimaserasi dengan metanol, kemudian sebanyak 5ml ekstrak methanol dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 10 ml aquadest dan dipanaskan pada penangas air. Lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit. Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam daun tumbuhan Senggani tidak terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2. Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoid pada daun tumbuhan Senggani, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. Serbuk daun tumbuhan Senggani diekstraksi maserasi dengan metanol, dikeringkan. Filtrat yang diperoleh ditambahkan pereaksi H2SO4(p), NaOH 10%, FeCl3 5% dan Mg-HCl, terjadilah perubahan warna pada setiap penambahan pereaksi yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid.
3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak etil asetat dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran Kloroform : Metanol dengan perbandingan (90 : 10)v/v ; (80 : 20)v/v; (70: 30)v/v; (60 : 40)v/v ; (50 : 50)v/v.
Prosedur analisis kromatografi lapis tipis :
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak Kloroform : Metanol dengan perbandingan (90 : 10) v/v ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat Etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang timbul dibawah sinar Ultra Violet dengan λ= 254 nm dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama
20)v/v;(70:30)v/v;(60:40)v/v;(50:50)v/v. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam daun tumbuhan Senggani terkandung senyawa flavonoid. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak Kloroform : Metanol(60:40)v/v.
Harga Rf dapat dilihat pada kromatogram (Lampiran 3).
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak Daun Tumbuhan Senggani
Serbuk daun tumbuhan Senggani ditimbang sebanyak 1500 g, dimasukkan ke dalam bejana dan ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama 72 jam dan sesekali diaduk. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak berwarna hijau. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator pada suhu 600C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksan, sehingga terbentuk lapisan n-heksan dan lapisan metanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan rotarievaporator. Ektrak pekat metanol di partisi dengan Etil asetat . Ektrak pekat etil asetat dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator, sehingga diperoleh ekstrak etil asetat sebanyak 15,5 g.
3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoid dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoid secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat Etil asetat daun tumbuhan Senggani yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60 G dan fasa gerak adalah campuran pelarut Kloroform : Metanol dengan perbandingan (90: 10)v/v;(80:20)v/v;(70:30)v/v(60:40)v/v;(50:50)v/v.
Prosedur isolasi senyawa flavonoid dengan kromatografi kolom:
Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 G dengan menggunakan n-Heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-Heksan 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 15,5 g ekstrak pekat Etil
asetat daun tumbuhan Senggani ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak kolom, lalu ditambahkan fasa gerak Kloroform : Metanol dengan perbandingan (90: 10)v/v;(80:20)v/v;(70:30)v/v(60:40)v/v;(50:50)v/v secara perlahan-lahan dan diatur aliran fasa gerak yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 10 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoid dan diuapkan sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal.
3.3.5. Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari hasil isolasi kromatografi kolom pada perbandingan (60:40)v/v dari fraksi 81-100 dilakukaan pemurnian senyawa, dengan cara KLT preparatif
Prosedur;
Senyawa hasil isolasi dipreparatif dengan menggunakan KLT preparatif. Senyawa tersebut ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler ke plat preparatif pada batas bawah dengan jarak 2 cm, kemudian dimasukkan ke dalam chamber untuk dielusi dengan menggunakan perbandingan campuran eluen kloroform:metanol (80:20)v/v. Dielusi + 2jam, kemudian dikeringkan plat dan dilihat kenaikan noda dibawah lampu UV. Setelah noda terpisah dengan baik , kemudian dilakukan penggerusan dan diambil senyawa dengan jarak noda yang sama. Senyawa tersebut dimasukkan kedalam kolom kecil untuk dielusi dengan metanol:etil asetat (1:1). Kemudian dikeringkan, diperoleh senyawa berupa kristal amorf berwarna kuning.
3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis(KLT)
Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak Kloroform : Metanol
(60:40)v/v.
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi Feri klorida dalam air menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid. Perlakuan yang sama dilakukan, dan difiksasi dengan Natrium Hidroksida dalam air yang menghasilkan bercak berwarna biru violet.
3.3.7. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Laboratorium PTKI Medan - Sumatera Utara (Lampiran 5).
3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis spektrum inframerah dengan spektrofotometer dilakukan di Laboratorium Bea Cukai Belawan – Sumatera Utara. (Lampiran 7).
3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Analisis ini dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Kimia-LIPI Tangerang dengan menggunakan Aseton sebagai pelarut dan TMS sebagai standart dalam spektrum absorbansi antara 0-12 ppm dibawah TMS (Lampiran 8).