BAB III BAHAN DAN METODE
3.3 Prosedur Penelitian
Metode yang digunakan dalam kegiatan lacak balak DNA kayu adalah dengan metode RAPD. Secara umum prosedur penelitian dengan metode RAPD dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9 Bagan prosedur teknik RAPD.
Pada penelitian ini, tidak dilakukan seleksi primer karena primer yang digunakan adalah primer yang telah digunakan pada penelitian Kholik (2008).
Data primer
NTSys
Popgene Deskriptif
Interpretasi dan analisis data PCR primer terbaik
Elektroforesis agar 2% Tidak
Pemotretan hasil amplifikasi Pewarnaan (staining) Database DNA Elektroforesis agar 2% PCR seleksi primer Pewarnaan (staining) Pewarnaan (staining) Elektroforesis agar 1% Tidak
Contoh uji kayu
3.3.1 Ekstraksi DNA
Ektraksi DNA merupakan metode pemisahan DNA dari bahan-bahan yang tidak diperlukan. Untuk mengurangi aktivitas enzim selama ekstraksi digunakan nitrogen cair, yang juga dapat mempermudah proses penghancuran bahan tanaman. Metode yang digunakan untuk ekstraksi adalah metode CTAB (Cetyl
Trimethyl Ammonium Bromide), dari Murray & Thompson (1980) yang telah
dimodifikasi Brown (1991) sebagaimana yang diacu dalam Yunanto (2006). Bahan yang akan dianalisis berupa contoh uji kayu Jati, dibor dalam keadaan steril menggunakan ukuran mata bor 2.5 mm. Pengambilan serbuk dilakukan pada bagian kayu gubal sebanyak 0.2 g dan dimasukan dalam tube. Serbuk tersebut kemudian ditambahkan 500-700 µL larutan buffer ekstrak (Tris-HCl 1M pH 8.0, NaCl 5M, EDTA 0.5M, CTAB 10%, merkaptoetanol, PVP 1% dan H2O) serta 100 µL PVP 2% kemudian divortex. Setelah itu dilakukan inkubasi di dalam mangkok porselin berisi air yang dipanaskan di atas kompor listrik selama 45 menit pada suhu 65oC. Stirer berukuran 5 mm dimasukan dalam
tube untuk mengoptimalkan ekstraksi selama proses inkubasi. Selama proses inkubasi, air dalam mangkuk porselin harus tetap dikontrol.
Untuk memisahkan antara cairan pelarut dengan cairan yang mengandung DNA (supernatant) ditambahkan chloroform IAA 500 μl dan fenol 10 μl, kemudian dikocok dan disentrifugasi pada kecepatan 13 000 rpm selama 2 menit. Hasil sentrifugasi terpisah menjadi dua fase yaitu bagian atas merupakan fase air yang berisi asam nukleat (supernatant) dan bagian bawah yaitu fase organik yang berisi pelarut organik. Cairan yang mengandung DNA (supernatant) dipindahkan ke dalam tube baru. Proses tersebut dilakukan sebanyak dua kali.
Untuk mendapatkan pellet DNA, supernatant ditambahkan isopropanol dingin 500 mikro liter dan NaCl 300 mikro liter dan disimpan di dalam freezer
selama 45 menit-1 jam. Pemberian isopropanol dingin dan garam NaCl menyebabkan pengendapan DNA dan terbentuknya benang-benang asam nukleat yang halus dan berwarna putih. Fase padat (pellet) dicuci dengan etanol 100% sebanyak 300 mikro liter yang ditambahkan ke dalam tube untuk memurnikan DNA dari sisa-sisa bahan kimia. Proses tersebut dilakukan 2 kali, kemudian dikeringkan di dalam desikator ±15 menit. Langkah terakhir adalah menambahkan
buffer TE sebanyak 20 μl. Hal ini dilakukan agar DNA lebih stabil. DNA akan lebih stabil dalam keadaan larutan dibandingkan dalam bentuk benang-benang halus. Buffer TE yang mengandung tris-HCL dan EDTA mampu mengkelat logam yang dapat menjadi kofaktor enzim nuklease (Sambrook et al. 1989, diacu dalam Nuryani 2003).
3.3.2 Proses Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR-RAPD (Polymerase Chain Reaction-Random Ampified Polymorphic DNA )
DNA hasil proses ekstraksi sebelum dilakukan proses amplifikasi harus dilakukan pengenceran dengan menggunakan aquabidest. Besarnya perbandingan antara DNA dengan aquabidest tergantung dari tebal dan tipisnya DNA genomik hasil ekstraksi.
Proses amplifikasi dengan metode RAPD menggunakan bahan kimia dari Promega. Secara umum proses amplifikasi DNA dengan metode PCR-RAPD menggunakan 4 komponen utama yang dicampurkan ke dalam microtube ukuran 0.2 ml. Komponen yang diperlukan untuk teknik RAPD disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Komposisi bahan untuk reaksi PCR pada teknik RAPD
No. Nama Bahan 1 Contoh Uji Reaksi X Sample Reaksi
1 H2O 2.5 μl X x 2.5 μl
2 Go Taq Green Master Mix Qit 7.5 μl X x 7.5 μl
3 Primer 1.5 μl X x 1.5 μl 4 Cetakan DNA 2 μl X x 2 μl
Primer yang digunakan adalah primer yang telah digunakan pada penelitian Kholik (2008), yaitu primer dari golongan OPO dan OPY. Primer dari golongan OPO yang digunakan untuk proses amplifikasi DNA adalah yang memiliki kode O10 dan O14. Sedangkan primer dari golongan OPY yang digunakan adalah yang memiliki kode Y13 dan Y20. Urutan basa nukleotida primer golongan OPO dan OPY (Yunanto 2006) disajikan pada Tabel 4.
Tabel 4 Urutan basa nukleotida primer (Operon Technology)
No. Primer Urutan Basa
1 OPO-10 5' TCAGAGCGCC '3
2 OPO-14 5' AGCATGGCTC'3
3 OPY-13 5' CACAGCGACA'3
4 OPY-20 5' AGCCGTGGAA'3
Secara umum, proses PCR melalui 3 tahapan penting yaitu denaturation,
annealing, dan extension. Dalam proses PCR dibutuhkan suhu yang berbeda-beda
tergantung pada teknik, bahan kimia, dan juga primer yang digunakan. Adapun tahapan dalam proses PCR dengan menggunakan teknik RAPD dapat dilihat pada Tabel 5.
Tabel 5 Tahapan proses PCR-RAPD
Tahapan Suhu Waktu Jumlah Siklus
Pra-denaturation 95oC 2 menit 1 Denaturation Annealing Extension 95oC 37oC 72oC 1 menit 2 menit 2 menit 45 45 45
Final Extension 72oC 5 menit 1
3.3.3 Uji Kualitas dan Kuantitas DNA
Untuk menguji kualitas DNA hasil ekstraksi dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar 1% (b/v), dimana 15 ml buffer TAE 1x dicampurkan dengan 0.15 gram agarose (untuk cetakan kecil 8-12 sumur), dan 33 ml buffer TAE dicampurkan dengan 0.33 gram agarose
(untuk cetakan besar 17-25 sumur). Campuran agar 1% tersebut dipanaskan di dalam microwave untuk selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan dan ditunggu sampai padat, kemudian disimpan di dalam bak elektroforesis yang berisi buffer
TAE.
Setelah agar yang padat berada di dalam bak elektroforesis, 3 µl Blue
Juice 10x dan 4 mikro liter DNA dicampurkan dan dimasukkan ke dalam
lubang-lubang di dalam agarose dengan menggunakan mikropipet. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 100 volt sekitar 30 menit. Pada prinsipnya, proses elektroforesis dilakukan dengan memigrasikan
DNA dalam gel agarose dari arus (-) ke arus (+). Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan Ethidium Bromida (EtBr) dengan konsentrasi 1% (v/v), dan selanjutnya pita DNA hasil isolasi dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator.
Untuk menguji kualitas DNA hasil PCR, dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose dengan konsentrasi sebesar 2% (b/v), dimana 15 ml
buffer TAE 1x dicampurkan dengan 0.30 gram agarose (untuk cetakan kecil 8-12
sumur), dan 33 ml buffer TAE dicampurkan dengan 0.66 gram agarose (untuk cetakan besar 17-25 sumur). Campuran agar 2% tersebut dipanaskan di dalam
microwave untuk selanjutnya dituangkan ke dalam cetakan dan ditunggu sampai
padat, kemudian disimpan di dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TAE. Elektroforesis dilakukan dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 80 volt sekitar 45-60 menit. Pada prinsipnya, proses elektroforesis dilakukan dengan memigrasikan DNA dalam gel agarose dari arus (-) ke arus (+). Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan dengan larutan Ethidium
Bromida (EtBr) dengan konsentrasi 1% (v/v). Selanjutnya pita DNA hasil isolasi
dilihat dengan menggunakan alat UV transilluminator lalu difoto untuk kemudian diinterpretasi dan dianalisis.