BAHAN DAN METODE
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1Hewan Percobaan
Penelitian ini menggunakan mencit (Mus musculus L.) jantan yang sehat dan fertil serta berumur 8-11 minggu dengan berat 24-25 g sebanyak 50 ekor, mencit tersebut diperoleh dari Balai Penyidikan Penyakit Hewan Sumatera Utara Medan dan dibagi dalam kelompok perlakuan dan kontrol. Mencit diberi makan dan minum secara ad-libitum (Smith & Mangkoewidjojo, 1988). Kandang mencit dijaga kebersihannya dan penanganan hewan percobaan sesuai dengan persyaratan kode etik yang berlaku. Diantaranya penanganan dengan penuh kasih sayang, pemberian makanan yang cukup gizi dan sehat serta memperhatikan kebersihan kandangnya. Sebelum penelitian dilakukan diajukan permohonan untuk mendapatkan ethical clearance ke Komisi Etik Penelitian Hewan di Wilayah Sumatera Utara Medan.
3.4.2 Pembuatan Ekstrak Air Biji Pepaya
Pembuatan ekstrak air biji pepaya (Carica papaya L.) dilakukan menurut cara (Chinoy, 1985 dalam Ilyas, 2001). Ekstrak Air biji pepaya disiapkan dengan mengumpulkan buah pepaya (Carica papaya L.) yang telah masak, yang berasal dari
kelurahan kemenangan Tani, Kecamatan Medan Tuntungan Komplek Adam Malik kota Madya Medan, Sumatera Utara. Biji pepaya kemudian dicuci dan dikeringkan dengan inkubator pada suhu 50°C sampai kering (kadar air 20%). Biji yang telah kering dihaluskan dengan diblender dan diayak dengan ayakan tepung sehingga didapatkan 300 g bubuk halus biji pepaya. Diambil sebanyak 300 g yang telah halus kemudian dimasukkan ke dalam bejana yang telah diisi air, selanjutnya dilakukan perebusan hingga mendidih, setelah mendidih air perebusan disaring dengan kertas saring hingga diperoleh hasil dan residu. Residu yang diperoleh direbus kembali hingga diperoleh hasil dan residunya lagi, begitu seterusnya sampai residu tidak dapat dipergunakan kembali. Hasil rebusan dipanaskan hingga diperoleh reindaimen sampai berwarna coklat tua dan kental 30 g. Reindaimen yang diperoleh selanjutnya dilarutkan kembali dengan aquabidestilata steril 500ml sesuai dengan kebutuhan penelitian. Kemudian diberikan secara oral dengan dosis 30 mg/0,5 ml/hari mencit jantan.
3.4.3 Uji Skrining Fitokimia Biji Pepaya
Uji skrinning fitokimia biji pepaya yang akan dilakukan meliputi pemeriksaan kandungan senyawa alkaloid, flavonoid, steroid dan terpenoid. Pemeriksaan senyawa ini sesuai dengan prosedur yang telah dilakukan oleh Harborne (1987) yaitu:
a. Uji Alkaloid
Biji pepaya kering yang telah dihaluskan, diambil sebanyak 3 g dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml methanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Meyer, tabung II ditetesi pereaksi Wagner, tabung III ditetesi pereaksi Bouchard dan tabung IV ditetesi pereaksi Dragendorf. Masing-masing tabung sebanyak 3-5 tetes. Kemudian diamati endapan yang terbentuk dan dicatat hasilnya.
b. Uji Flavanoid
Biji pepaya kering yang telah dihaluskan, diambil sebanyak 3 g dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml methanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi FeCl3, tabung II ditetesi MgHCl, tabung III ditetesi H2SO4(p) dan tabung IV ditetesi NaOH 10%. Masing-masing tabung sebanyak 3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat hasilnya.
c. Uji Steroid
Biji pepaya kering yang telah dihaluskan, diambil sebanyak 3 g dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml n-heksan. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO4 1%, tabung II ditetesi reagen Salkowsky (H2SO4)p, tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Masing-masing tabung sebanyak 3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya.
d. Uji Terpenoid
Biji pepaya kering yang telah dihaluskan, diambil sebanyak 3 g dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 100ml kloroform. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO4 1%, tabung II ditetesi reagen Salkowsky (H2SO4)p, tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Masing-masing sebanyak 3-5 tetes. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya.
3.4.4 Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat (TU) dan Ekstrak Air Biji
Pepaya (Carica papaya L.)
Testosteron undekanoat (TU) 1000mg/4mL (buatan Schering AG Jerman) dan ekstrak air biji pepaya (Carica papaya L.) 30 mg/0,5ml/hari/mencit jantan dirancang jumlahnya dengan membandingkan dosis yang diberikan pada manusia. Perbandingan berat relawan (50 kg=50.000 g) dengan mencit adalah (25 g) adalah 2000:1. Pada uji klinik digunakan 500 mg TU, maka dosis penyuntikan pada tiap ekor mencit adalah 1/2000x500 mg TU = 0,25mg TU (Ilyas, 2007). Sedangkan ekstrak air biji pepaya 30
mg/25 g berat badan mencit (Ilyas, 2001). Interval waktu injeksi intramuskular TU 6 minggu dan pencekokan ekstrak air biji pepaya setiap hari. Kondisi penelitian terdiri dari lima (5) bagian perlakuan dan kontrol.
Perlakuan penyuntikan TU dimulai dari hari ke 0 dengan interval 6 minggu selama 24 minggu, penyuntikan TU melalui intramuskular dengan menggunakan spuit sebanyak 0,25mg/0,1ml/mencit. Pemberian TU ini berdasarkan penelitian Kamischake et al. (2001) dalam Ilyas (2008), yang menyatakan bahwa injeksi TU dengan interval 6 minggu telah dapat menekan spermatogenesis, sedangkan pencekokan ekstrak biji pepaya dengan dosis 30mg/0,5 ml/mencit jantan diberikan setiap hari melalui oral (gavage) selama 24 minggu. Pengamatan parameter penelitian dilakukan dengan membedah mencit dengan setiap kelompok perlakuan (Tabel 3.1) setiap interval 6 minggu. Pada minggu ke 6 dilakukan pembedahan mencit dengan cara dislokasi leher untuk diambil hatinya, kemudian diamati parameter pengamatan yang terdiri dari morfologi yang meliputi permukaan hati dan warna hati. Dilakukan juga parameter untuk minggu ke 12, ke 18, dan ke 24. Masing-masing kelompok diberikan ekstrak air biji pepaya dan TU dari hari ke 0 selama 6 minggu untuk perlakuan P1, kemudian P1 dibedah semuanya pada minggu ke 6, selanjutnya P2, P3, dan P4 dibedah semua mencit dan diamati sesuai parameter pengamatan ( Gambar 3)
Kontrol
Minggu
Gambar 3. Jadwal kegiatan pemberian TU + ekstrak air biji pepaya selama 24 minggu.
0 6 12 18 24
Injeksi TU 0,25 mg/0,1ml/mencit jantan dan interval waktu selama 6 minggu
0 6 1 18 24
Pemberian ekstrak air biji papaya (30mg/0,5ml/mencit jantan/ hari)
3.4.5 Pembuatan Preparat Histologi Hati Mencit Jantan dengan Metode Parafin
Menurut Suntoro (1983), urutan kerja pembuatan preparat yang dilakukan dengan metode parafin adalah sebagai berikut:
a. Fiksasi, setelah mencit (Mus musculus L.) didislokasi dan dibedah, diambil organ hati kemudian dicuci dengan larutan NaCl 0,9%, lalu difiksasi dengan larutan bouin selama 1 malam.
b. Pencucian (washing), setelah hati difiksasi, dilakukan pencucian dengan menggunakan alkohol 70% yang berguna untuk menghilangkan larutan fiksasi dari jaringan.
c. Dehidrasi, langkah ini dilakukan setelah proses pencucian selesai, dengan menggunakan alkohol bertingkat dimulai dari alkohol 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, dan alkohol absolut. Botol yang berisi hati tersebut digoyang-goyangkan terus menerus (shaker) dengan menggunakan tangan agar proses dehidrasinya lebih cepat.
d. Penjernihan (clearing), penjernihan dilakukan dengan menggunakan perbandingan alkohol:xylol 3:1, 1:1, 1:3 masing-masing 1 jam dan berakhir dengan xylol murni diinapkan selama 1 malam.
e. Infiltrasi, proses infiltrasi dilakukan di dalam oven dengan suhu 56ºC, menggunakan perbandingan xylol:parafin 3:1, 1:1, 1:3 dan berakhir diparafin murni masing-masing selama 1 jam.
f. Penanaman (embedding), setelah proses infiltrasi, selanjutnya dilakukan proses penanaman dalam parafin, sebelum melangkah ke proses ini yang harus disiapkan adalah mencairkan parafin, membuat kotak-kotak dari karton atau kalender bekas untuk tempat penanaman, menyiapkan lampu spritus, menyediakan pinset kecil, dan menyediakan label. Setelah semuanya telah siap, proses embedding dimulai dengan menuangkan parafin yang telah cair kedalam kotak-kotak karton tadi, selanjutnya ambil organ tersebut dengan cepat dari parafin murni dengan menggunakan pinset kecil lalu dimasukkan ke dalam kotak yang telah berisi parafin cair tadi, biarkan hingga parafin menjadi keras sampai terbentuk blok-blok parafin.
g. Penyayatan (section), penyayatan atau pemotongan dilakukan dengan memotong blok parafin yang telah ditempelkan pada holder kemudian
dipasang pada mikrotom, lalu diputar sampai blok parafin yang berisi organ tadi terpotong menjadi pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6-10µm. h. Penempelan (affiksing), penempelan dilakukan dengan mengambil beberapa
pita parafin yang telah terpotong dengan menggunakan skapel, kemudian ditempelkan pada objek glass, lalu dicelupkan ke dalam air dingin (air biasa) kemudian kedalam air panas. Lalu diletakkan diatas hotplate beberapa detik untuk melekatkan pita parafin ke objek glass.
i. Pewarnaan (staining), pewarnaan sedian hati, diwarnai dengan menggunakan pewarnaan Hematoxylin-Eosin. Tahapan pewarnaannya adalah sebagai berikut:
- Deparafinasi: dilakukan dengan mencelupkan objek glass yang telah berisi irisan jaringan tadi ke dalam xylol selama ±15 menit.
- Dealkoholisasi: dilakukan secara bertingkat dengan alkohol kosentrasi menurun, dengan alkohol absolut, alkohol 96%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, dan 30%.
- Pewarnaan: dilakukan dengan cara objek glass yang telah berisi irisan jaringan tadi dimasukkan ke dalam larutan pewarna Hematoxilin Erlich selama 3-7 menit, dicuci dengan air mengalir ± 10 menit, dimasukkan ke dalam alkohol 30%, 50%, dimasukkan ke dalam larutan pewarna eosin 0,5% dalam alkohol 70% selama 1-3 menit, preparat dimasukkan berturut-turut ke dalam alkohol 60%, 70%, 80%, 90%, 96%, dan alkohol absolut, dikeringkan dengan kertas pengisap selanjutnya, preparat dimasukkan ke xylol.
j. Penutupan (mounting), dari xylol jaringan kemudian ditutup dengan cover glass setelah ditetesi dengan Canada balsam terlebih dahulu. Setelah itu diberi label dan diamati di bawah mikroskop.
3.5Parameter Pengamatan
3.5.1 Pengamatan Morfologi Hati
Pengamatan morfologi hati dilakukan dengan cara: mencit jantan (Mus musculus L.) didislokasi dan dibedah, diambil organ hati serta diamati hati. Organ hati kemudian dilakukan pengamatan terhadap gambaran morfologi. Pengamatan gambaran
morfologi hati meliputi permukaan luar hati dan warna hati. Penilaian disebut normal bila permukaan rata dan halus serta berwarna merah kecoklatan, sedangkan abnormal jika permukaan ditemukan jaringan ikat, kista kecil, permukaan yang benjol-benjol atau abses yang menunjukkan perubahan warna (Robbins & Kumar, 1992).
3.5.2 Pengamatan Preparat Histologi Hati
Menurut Jawi (2007), preparat histologi hati (hepar) dapat dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya dalam 5 lapangan pandang yang berbeda, dengan perbesaran 400 kali. Setiap lapangan pandang dihitung 40 hepatosit. Dengan jenis kerusakan hepar yang meliputi nekrosis, steatosis, dan degenerasi hidrofik. Kemudian dicatat dan dihitung jumlah persentase kerusakan yang terjadi.
