Struktur Flavanon
4. Daerah sidik jari “finger print”, 1.500 – 700 cm -1
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyedian Sampel
Sampel yang diteliti adalah kulit buah Tumbuhan Jengkol yang diperoleh dari Pasar Central,Medan. Kulit Buah Tumbuhan Jengkol dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk sebanyak 1900 gram.
3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Kulit Buah Tumbuhan Jengkol
Serbuk kulit buah Tumbuhan Jengkol diidentifikasi dengan menggunakan cara : 1. Uji busa
2. Skrining Fitokimia
3.3.2.1. Uji Busa
Serbuk kulit buah tumbuhan Jengkol sebanyak 5 g dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambah 10 ml akuades dan dipanaskan pada penangas air. Lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit. Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa didalam kulit buah tumbuhan Jengkol tidak terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2. Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada kulit buah tumbuhan Jengkol maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. Serbuk kulit diekstraksi maserasi dengan metanol, lalui disaring. Filtrat yang diperoleh ditampung dan diteteskan pada plat skrining untuk diuji dengan pereaksi H2SO4(P), NaOH 10%, FeCl3 1% dan MgHCl kemudian diperhatikan perubahan warna yang terjadi terhadap ekstrak sampel.
3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak aseton dengan
menggunakan fasa diam silika gel 60F254. Fasa gerak yang digunakan adalah
campuran CHCl3 : MeOH dengan perbandingan (90 : 10)v/v ; (80 : 20)v/v ; (70 : 30)v/v .
Prosedur analisis kromatografi lapis tipis :
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak CHCl3 : MeOH dengan perbandingan (90 :
10)v/v kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat methanol pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari dalam bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang dihasilkan dibawah sinar
Ultra Violet dengan λ = 254 nm dan dihitung harga Rf-nya, selanjutnya dimasukkan
kedalam botol pereaksi FeCl3 1%. Perlakuan yang sama dilakukan untuk
menunjukkan bahwa di dalam kulit buah tumbuhan Jengkol terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak CHCl3 : MeOH (80 :
20) v/v. Harga Rf dapat dilihat pada kromaatogram (Lampiran C)
3.3.3. Prosedur untuk memperoleh senyawa kimia dari Ekstrak Kulit Buah Tumbuhan Jengkol
Serbuk kulit buah tumbuhan Jengkol ditimbang sebanyak 1900 g, dimasukkan kedalam botol perendaman dan ditambahkan pelarut methanol yang telah didestilasi sampai semua serbuk terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama ± 72 jam dan sesekali diaduk. Maserat ditampung dan diperoleh ekstrak berwarna hijau. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan pelarut methanol sampai ekstrak methanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negative pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak methanol yang diperoleh dikumpulkan dan
dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator pada suhu ± 63oC sehingga
diperoleh ekstrak pekat methanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksana sebanyak ± 7 kali, sehingga terbentuk lapisan n-heksana dan lapisan methanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan, dan dilakukan kemudian dilarutkan dengan aseton. Dilakukan skrining fitokimia dengan pereaksi yang menghasilkan uji positif dengan peraksi. Selanjutnya dipekatkan sampai diperoleh ekstrak pekat aseton sebanyak ± 8,3 gram.
3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat aseton kulit buah Tumbuhan Jengkol yang tealh diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah
silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fase gerak adalah campuran pelarut CHCl3 :
MeOH dengan perbandingan (80 : 20) v/v.
Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel dicampur dengan ekstrak pekat aseton dengan menggunakan pelarut n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform 100% hingga silika gel padat dan tidak menghasilkan
gelembung(bubble)/patahan. Lalu ditambahkan fase gerak CHCl3 : MeOH mulai dari
(90 : 10)v/v ; (80 : 20)v/v ; (70 : 30)v/v. secara perlahan-lahan dan diatur aliran fase gerak yang keluar dari kolom sama banyaknya denga setiap penambahan fase gerak dengan ratio yang berbeda dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 25 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoida dan diuapkan sampai pelarutnya habis sehingga terbentuk kristal.
3.3.5. Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari fraksi yaitu pada fraksi 30 – 51 dilakukan pemurnian senyawa atau pemurnian untuk memastikan kemurniannya.
Prosedur :
Senyawa pada fraksi 30 – 51 dipreparatif dengan menggunakan KLT Preparatif. Senyawa tersebut ditotolkan dengan menggunakan pipa kapiler ke plat preparatif pada batas bawah dengan jarak 2 cm, kemudian dimasukkan kedalam chamber untuk di elusi dengan menggunakan perbandingan campuran eluent n-heksan dan aseton (120 : 80 )v/v. Dielusi selama ± 2 jam selanjutnya dikeringkan plat dan dilihat kenaikan noda dibawah lampu UV dengan panjang gelombang lampu yang berbeda, dilakukan penggerusan dan diambil senyawa dengan jarak noda yang sama, dilakukan pelarutan dengan menggunakan campuran eluent CHCl3 : MeOH (120 : 180) v/v. ditampung dan dilakukan rekristlalisasi dengan menggunakan campuran eluent etanol : n-heksan sebanyak ± 6 kali.
3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Kromatografi dengan KLT
Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis dengan
menggunakan fase diam silika gel 60 F254 dengan fase gerak CHCl3 : MeOH (80 :
20)v/v.
Prosedur :
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak kedalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fase gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi Feri Klorida 1 % menghasilkan bercak hitam yang menunjukkan uji positif adanya senyawa flavonoida. Perlakuan yang sama dilakukan, dan difiksasi dengan Natrium Hidroksida 10 % yang menghasilkan bercak berwarna biru violet. (Lampiran D)
3.3.7. Analisis spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer UV-Vis
Analisis ini dilakukan di Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Serpong-Tangerang (Lampiran E)
3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer FT-IR
Analisis ini dilakukan di Pusat Penelitian Kimia-LIPI, Serpong-Tangerang (Lampiran F)
3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi dengan Spektrofotometer Resonansi
Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Analisis ini dilakukan di Pusat Penelitian Kimia LIPI Serpong – Tangerang dengan
menggunakan DMSO-d6 sebagai pelarut dan TMS sebagai standart dalam spektrum
