Prosedur Penelitian

1. Pembuatan Kitin

Proses isolasi kitin sendiri terdiri atas tiga tahap, yaitu: deproteinasi yang merupakan proses pemisahan protein dari kulit udang, demineralisasi yang merupakan proses pemisahan mineral, dan depigmentasi yang merupakan tahap pemutihan kitin. Namun pada penelitian ini tidak dilakukan tahap depigmentasi karena kitin yang dihasilkan tidak untuk dikomersilkan. Depigmentasi bertujuan untuk menghilangkan zat warna (pigmen) yang terdapat pada sampel (kulit udang) dari kitin. Proses depigmentasi

sesungguhnya telah berlangsung pada saat pencucian residu setelah proses deproteinasi dan demineralisasi (Sari, 2010).

1.1. Deproteinasi

Sebanyak 50 gram sampel ditempatkan dalam bejana tahan asam dan basa yang dilengkapi pengaduk dan termometer, dan diletakkan dalam penangas air. Kemudian sampel ditambahkan 500 mL NaOH 20 % dan didiamkan selama 1 jam pada suhu 90^oC (Pareira, 2004). Setelah itu, dilakukan penyaringan sehingga diperoleh residu dan filtrat. Filtrat diuji dengan CuSO4untuk membuktikan bahwa protein berhasil

dipisahkan dari kitin melalui deproteinasi. Protein dengan CuSO4akan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Residunya dicuci dengan akuades hingga pH netral. Pencucian ini dimaksudkan untuk mencegah terjadinya degradasi produk selama proses pengeringan (Sari, 2010). Kemudian residu dikeringakan dalam oven dengan suhu 60^oC selam 24 jam.

1.2. Demineralisasi

Kitin kasar hasil deproteinasi dimasukkan dalam bejana tahan asam dan basa yang dilengkapi dengan pengaduk, termometer dan diletakkan dalam penangas air. Kemudian sampel ditambahkan HCl 1,25 N dengan perbandingan 1:10 (w/v) selama 1 jam pada suhu 90^oC

(Pareira, 2004). Setelah itu, dilakukan penyaringan sehingga diperoleh residu dan filtrat. Terjadinya pemisahan mineral ditunjukkan dengan terbentuknya gas CO2yang berupa gelembung-gelembung udara pada saat larutan HCl ditambahkan kedalam sampel. Filtrat diuji dengan

amonium oksalat untuk membuktikan bahwa mineral kalsium berhasil dipisahkan dari kitin melalui demineralisasi. Ion oksalat akan

membentuk endapan putih dengan kalsium. Residunya dicuci dengan akuades sampai pH netral yang diukur dengan indikator universal. Pencucian dimaksudkan untuk mencegah terjadinya degradasi produk selama proses pengeringan (Sari, 2010). Kemudian residu dikeringkan dalam oven pada suhu 60^oC selama 24 jam, sehingga diperoleh kitin berwarna kuning kemerahan.

2. Karakterisasi Kitin dengan FTIR

Kitin murni yang diperoleh melalui dua tahap yaitu deproteinasi dan

demineralisasi dibaca dengan Spektrofotometer IR. Kitin dibuat pelet dengan KBr, kemudian dilakukanscanningpada daerah frekuensi antara 4000 cm^-1 sampai dengan 400 cm^-1. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan hasil pembacaan kitin standar.

3. Pembuatan Media

3.1. Media ISP-2 (International Streptomyces Project-2)

Media ISP–2 terdiri dari 4 gramyeast exstract, 10 grammalt exstract, 4 gram dekstrosa, dan 20 gram agar dilarutkan dalam 1 L air laut steril kemudian disterilkan denganautoclavepada suhu 121^oC dan tekanan 2 atm. Setelah media sedikit dingin, ditambahkancycloheximide(25μg/mL) dannalidixic acid(25μg/mL) (Margaveyet al., 2004).

3.2. Larutan Mineral GaramActinomycetesANL-4

Larutan ini terdiri dari 0,4% (NH₄)₂SO₄, 0,6% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,01% MgSO4, 0,01% CaCl, dan 0,5% kitin. Larutan disterilkan dengan

autoclaveselama 20 menit pada suhu 121^oC dan tekanan 2 atm.

3.3. Media FermentasiMucor miehei

Larutan ini terdiri dari laktosa 0,1 gram, bakto pepton 0,3 gram, (NH₃)₂SO₄1,4 gram, urea 0,3 gram, KH₂SO₄2 gram, FeSO₄.7H₂O 0,3 gram, CaCl20,3 gram, ZnSO4.7H2O 0,287 gram, dan 1 gram kitin terakhir dilarutkan dalam buffer sitrat pH 4 sampai 100 mL. Selanjutnya campuran dikocok dengan bantuan magnetik stirer sampai homogen lalu disterilisasi dalamautoclavedengan suhu 121^oC dan tekanan 2 atm selama 20 menit.

3.4. MediaPotato dextrose Liquid(PDL)Mucor miehei

Sebanyak 200 gram kentang diiris halus lalu direbus dalam 500 ml akuades selama 1-1,5 jam serta disaring dengan kain tipis berlapis kapas, sehingga diperoleh cairan ekstrak kentang yang bening. Kemudian ditambahkan dekstrosa 10 gram lalu panaskan dan aduk hingga homogen. Aquades ditambahkan lagi hingga diperoleh volume akhir 1000 ml Sterilisasi medium denganautoclavepada suhu 121^oC, 2 atm selama 20 menit.

3.5. Larutan Buffer Pospat pH 7

Sebanyak 0,964 g NaH₂PO₄.H₂O dan 0.8078 g Na₂HPO₄.7H₂O dilarutkan dalam 100 mL air kemudian dicek pH-nya. Ditambahkan NaOH atau H₃PO₄bila dibutuhkan. Ini merupakan buffer pospat pH 7 1 M.

3.6. Larutan Buffer Sitrat pH 4

Campurkan 33 mL larutan stok asam sitrat 0,1 M dan 17 mL larutan stok natrium sitrat 0,1 M dan encerkan dengan akuades sampai 100 ml untuk mendapatkan larutan buffer pH 4.

4. PertumbuhanActinomycetesANL-4

StrainActinomycetesyang digunakan adalah ANL–4 yang telah berhasil diisolasi dari sedimen mangrove pantai, ciri–ciri strain ini memiliki miselium

aerialberwarna putih keabuan dan miselium substratnya berwarna krem keabuan. StrainActinomycetesditumbuhkan dalam media ISP-2. 25μg/mL

cycloheximidedan 25μg/mLnalidixic acidditambahkan untuk menghindari kontaminasi jamur dan bakteri (Margaveyet al., 2004).

5. Persiapan InokulumActinomycetesANL-4

Spora kultur 7–9 hari dipisahkan dan diinokulasikan ke dalam tabung

Erlenmayer 250 mL berisi 100 mL larutan mineral garam. Tabung diletakkan padashakerdengan kecepatan 175 rpm pada suhu 30°C selama 7 hari.

6. PertumbuhanMucor mieheipada Media PDL

Pada media PDL diinokulasikan 1 ose biakanMucor mieheikemudian diguncang denganshakerselama 4 hari dengan kecepatan 120 rpm.

7. Persiapan StarterMucor miehei

Starter dibuat dengan cara biakanMucor miehei yang telah tumbuh pada media PDL, dimasukkan dalam campuran media fermentasiMucor mieheisebanyak 100 mL, kemudian diguncang denganshakerselama 4 hari pada kecepatan 120 rpm.

8. Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch) Kitin Tahap I dengan ActinomycetesANL-4

Fermentasibatchdilakukan dengan menggunakanfermentordengan sistem tertutup. Substrat yang digunakan adalah kitin. Sebelum digunakan kitin direbus dengan 0,5% NaOH selama satu jam berdasarkan metode Grayet al

(1978). Selanjutnya kitin dibilas dengan akuades, lalu disaring dan dikeringkan.

Sebanyak 10 g substrat kitin dimasukkan dalam Labu Duran 250 mL. Substrat kemudian direndam dengan 50 mL larutan mineral garam yang terdiri dari 0,4% (NH4)2SO4, 0,6% NaCl, 0,1% KH2PO4, 0,01% MgSO4, 0,01 % CaCl. pH larutan dikondisikan pada 7,0 dengan menggunakan buffer pospat pH 7 kemudian media disterilisasi denganautoclavepada 2 atm temperatur 121^oC selama 20 menit. Sebanyak 50 mL kultur awal diinokulasikan dalam media

kitin dan difermentasi pada 30 °C denganshaking250 rpm selama 45 hari (Chahalet al., 1996).

Sejumlah hasil dari fermentasibatchdipanaskan denganwaterbathpada suhu 70^oC selama 45 menit. Kemudian dicampurkan dengan 45 mL air destilasi dengan membiarkan tabung padarotary shakerselama 1 jam pada 200 rpm. Campuran disaring menggunakan kain katun dan filtrat di sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4^oC. Semua filtrat yang diperoleh dibekukan di dalam pendinginfrezeerselama 24 jam, kemudian diliofilisasi dengan menggunakanfrezee dryersampai terbentuk kristal Glukosamin.

9. Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch) Kitin Tahap II dengan Mucor miehei

Substrat kitin pada fermentasi tahap I denganActinomycetesANL-4 yang tidak terdegradasi dibilas dengan akuades kemudian dimasukkan dalam Labu Duran 250 mL. Substrat kemudian direndam dengan 50 mL media

fermentasiMucor miehei yang terdiri dari laktosa 0,1 gram, bakto pepton 0,3 gram, (NH3)2SO41,4 gram, urea 0,3 gram, KH2SO42 gram, FeSO4.7H2O 0,3 gram, CaCl₂0,3 gram, ZnSO₄.7H₂O 0,287 gram,. pH larutan dikondisikan pada 4,0 dengan menggunakan buffer sitrat pH 4 kemudian media disterilisasi denganautoclevepada 2 atm temperatur 121^oC selama 20 menit. Sebanyak 50 mL starter diinokulasikan dalam media kitin dan difermentasi pada 30 °C denganshaking250 rpm selama 7 hari (Chahalet al., 1996).

Sejumlah hasil dari fermentasibatchdipanaskan denganwaterbathpada suhu 70^oC selama 45 menit. Kemudian dicampurkan dengan 45 mL air destilasi dengan membiarkan tabung padarotary shakerselama 1 jam pada 200 rpm. Campuran disaring menggunakan kain katun dan filtrat di sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4^oC. Semua filtrat yang diperoleh dibekukan di dalam pendinginfrezeerselama 24 jam, kemudian diliofilisasi dengan menggunakanfrezee dryersampai terbentuk kristal glukosamin.

Sedangkan substrat hasil pemisahan dari filtrat kemudian dicampurkan dengan asam asetat 5% dengan perbandingan 1:100 dengan membiarkan tabung padarotary shakerselama 1 jam pada 200 rpm. Campuran disaring menggunakan kain katun dan filtrat di sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4^oC. Semua filtrat yang diperoleh dibekukan di dalam pendinginfrezeerselama 24 jam, kemudian diliofilisasi dengan menggunakanfrezee dryer sampai terbentuk kristal kitosan.

10. Karakterisasi Glukosamin

10.1. Analisis dengan HPLC

•Pembuatan Standar Glukosamin.

50 mg standar glukosamin dilarutkan dalam 25 mL akuabides.

Kemudian didiamkan selama ±24 jam dan diperoleh konsentrasi akhir 2000 ppm.

•Pemeriksaan Sampel Glukosamin Hasil Isolasi.

Dibuat larutan stok yang terdiri dari 1 mLfenilisothiosianatedan 9 mL metanol dalam labu ukur 10 mL hingga batas ukur. Kemudian dibuat sampel glukosamin dengan dilarutkan 10 mg sampel dalam larutan CH₃COONa 0,1 M pada labu ukur 10 mL. Dimasukan 1 mL sampel glukosamin hasil isolasi ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian ditambahkan 80 μ L stokfenilisothiosianatedan 6 mL metanol serta akuades hingga tanda batas labu ukur. Selanjutnya diambil 5 mL, dipanaskan selama ± 15 menit pada suhu 80°C lalu didinginkan pada suhu ruang. Larutan ini diekstraksi dengan 5 ml eter untuk

membebaskanfenilisohtiosianateyang tidak bereaksi. Lapisan air dibaca dengan HPLC-ELSD (Evaporative Light Scattering Detection) menggunakan kolom C18, fasa gerak adalah asetonitril/H₂O (65/35) yang merupakan campuran pelarut polar, laju alir 0,8 mL/menit, laju gas nitrogen 1,6 L/menit, suhu nebulisasi 40^oC, suhu evaporasi 30^oC, dan waktu run 6 menit (Jacyno, 2004).

10.2. Analisis dengan FTIR

Glukosamin yang diperoleh dibaca dengan Spektrofotometer IR. Sampel glukosamin dibuat pelet dengan KBr, kemudian dilakukan

scanningpada daerah frekuensi antara 4000 cm^-1sampai dengan 400 cm^-1. Hasil yang diperoleh dibandingkan dengan hasil pembacaan glukosamin standar WAKO Jepang.

V. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :

1. Produk fermentasibatchkitin denganActinomycetesANL-4 danMucor miheipada spektrum FTIR secara kualitatif memiliki pita serapan pada bilangan gelombang yang relatif yang sama dengan glukosamin standar WAKO Jepang.

2. Kromatogram HPLC produk fermentasibatchkitin denganActinomycetes

ANL-4 danMucor miheimempunyai puncak dengan rentang waktu retensi masing-masing 2,1-3 menit dan 2-3 menit. Glukosamin standar WAKO Jepang memiliki puncak dengan rentang waktu retensi 2-3 menit. 3. Fermentasibatchkitin secara bertahap denganActinomycetesANL-4 dan

Mucor miheicukup efektif untuk pembuatan glukosamin.

4. Efektivitas fermentasibatchkitin denganActinomycetesANL-4 sebesar 41,98 %, sedangkan denganMucor mieheisebesar 49,92 %.

5. Efektivitas Fermentasibatchkitin secara bertahap denganActinomycetes

ANL-4 danMucor miheisebesar 91,90 % dengan substrat awal sebanyak 10 gram.

B. Saran

Dari hasil penelitian yang diperoleh, maka disarankan untuk mempersiapkan sampel glukosamin lebih kering lagi atau bebas air sebelum dianalisis gugus fungsinya dengan menggunakan FTIR dan menggunakan kolom karbohidrat untuk analisis kemurnian glukosamin dengan HPLC.

(Skripsi)

Oleh