BAHAN DAN METODE
3.4 Prosedur Penelitian 1 Hewan Percobaan
Penelitian ini menggunakan mencit jantan (Mus musculus L.) yang sehat dan fertil, berumur 8-11 minggu dengan berat badan 25-30 g sebanyak 50 ekor. Mencit tersebut diperoleh dari Balai Penyidikan Penyakit Hewan Sumatera Utara- Medan dan dibagi dalam kelompok perlakuan dan kontrol. Mencit diberi makan dan minum secara ad-libitum (Mangkoewidjojo & Jhon, 1988). Kandang mencit dijaga kebersihannya dan diberi sirkulasi udara yang baik. Penanganan hewan percobaan sesuai dengan persyaratan kode etik yang berlaku. Diantaranya penanganan dengan penuh kasih sayang, pemberian makanan yang cukup gizi dan sehat serta memperhatikan kebersihan kandangnya. Sebelum penelitian dilakukan permohonan untuk mendapatkan ethical clearance dari Komisi Etik Penelitian Hewan di Wilayah Sumatera Utara.
3.4.2 Pembuatan Ekstrak Air Biji Pepaya (Carica papaya L.)
Metode pembuatan ekstrak air biji pepaya (Carica papaya L.) dilakukan menurut Chinoy (1985) dalam Ilyas (2001). Disiapkan buah pepaya yang telah masak yang
dikumpulkan dari Keluarahan Kemenangan Tani, Kecamatan Medan Tuntungan, Komplek Adam Malik, Kotamadya Medan, Sumatera Utara. Biji pepaya diambil dan dicuci sampai bersih, kemudian dikeringkan dengan oven sampai kering pada suhu500 Celsius selama 3 hari. Biji yang telah kering kemudian dihaluskan dengan blender dan diayak dengan ayakan tepung sehingga didapatkan 300 g serbuk halus biji pepaya. Biji pepaya yang telah menjadi serbuk kemudian dimasukkan dalam bejana berisi air dan dipanaskan di atas hotplate hingga mendidih. Air biji pepaya yang telah mendidih kemudian disaring dengan kertas saring. Hasil saringan dipanaskan kembali sampai diperoleh rendemen (ekstrak kental berwarna coklat kehitaman). Sebanyak 30 g ekstrak tersebut kemudian dilarutkan dalam 500 mL aquabidestilata.
3.4.3 Uji Skrinning Fitokimia Biji Pepaya
Uji skrinning fitokimia biji pepaya yang akan dilakukan meliputi pemeriksaan kandungan senyawa flavanoid, alkaloid, steroid dan terpenoid. Pemeriksaan senyawa ini sesuai dengan prosedur yang telah dilakukan oleh Harborne (1987), yaitu:
a. Uji Flavanoid
Biji pepaya kering yang telah dihaluskan, dimasukkan sebanyak 3 g kedalam erlenmeyer yang berisi 100 mL methanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi FeCl3, tabung II ditetesi MgHCl, tabung III ditetesi H2SO4(p) dan tabung IV ditetesi NaOH 10%. Kemudian diamati perubahan warna yang terjadi dan dicatat hasilnya.
b. Uji Alkaloid
Biji pepaya yang telah kering kemudian dihaluskan dan dimasukkan sebanyak 3 g ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 mL methanol. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 4 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Meyer, tabung II ditetesi pereaksi Wagner, tabung III ditetesi pereaksi Bouchard dan tabung IV ditetesi pereaksi Dragendorf. Kemudian diamati endapan yang terbentuk dan dicatat hasilnya.
Tanpa Perlakuan
Pencekokan Ekstrak Air Biji Pepaya (30/ekor/mencit jantan/hari)
Injeksi TU 2,5mg/ekor interval 6
minggu
c. Uji Steroid
Biji pepaya kering dihaluskan dan dimasukkan sebanyak 3 g ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 mL n-heksan. Kemudian dipanaskan hingga ¼ volume awal dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO4 1%, tabung II ditetesi reagen Salkowsky (H2SO4)p, tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya.
d. Uji Terpenoid
Biji pepaya kering dihaluskan dan dimasukkan sebanyak 3 g ke dalam erlenmeyer yang berisi 100 mL kloroform. Kemudian dipanaskan dan disaring. Ekstrak yang terbentuk dimasukkkan ke dalam 3 buah tabung reaksi. Tabung I ditetesi CeSO4 1%, tabung II ditetesi reagen Salkowsky (H2SO4)p, tabung III ditetesi Libermen-Bouchard. Kemudian diamati perubahan warna dan dicatat hasilnya.
3.4.4 Pemberian Kombinasi Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) dan Testosteron Undekanoat (TU)
Pemberian Kombinasi Testosteron Undekanoat (TU) dan Air Biji Pepaya (Carica papaya L.) diberikan dengan membandingkan dosis pada manusia. Perbandingan berat relawan (50 kg=50.000 g) dengan mencit adalah (25 g) adalah 2000:1. Pada uji klinik digunakan 500 mg TU, maka dosis penyuntikan pada tiap ekor mencit adalah 1/2000x500 mg TU = 0,25mg TU (Moeloek et al., 1994; Ilyas, 2007). Sedangkan air biji pepaya 30 mg/0,5ml/hari/25 g berat badan mencit (Ilyas, 2001). Interval waktu injeksi intramuskular TU 6 minggu dan pencekokan air biji pepaya setiap hari sampai 24 minggu (Gambar 4).
Gambar 3. Jadwal Kegiatan Pemberian Ekstrak Biji Pepaya + TU Minggu 0 Minggu 6 Minggu 12 Minggu 18 Minggu 24 Kontrol Perlakuan
3.4.5 Pembuatan Preparat Histologis Testis dengan Metode Parafin
Setelah dilakukan pembedahan setiap 6 minggu, organ testis mencit diambil dan diamati morfologinya (berat dan volume). Kemudian organ tersebut disiapkan untuk dibuat preparat histologi. Pembuatan preparat histologi menurut Suntoro (1983), dilakukan dengan metode parafin sebagai berikut:
a. Fiksasi
Testis mencit (Mus musculus L.) segar dibilas dengan larutan NaCl 0,95% kemudian difiksasi selama 1 malam dalam larutan BOUIN.
b. Washing (Pencucian)
Setelah difiksasi, testis dibilas dengan Alkohol 70% dan direndam selama 1 malam. c. Dehidrasi
Dehidrasi dibilas dalam Alkohol berturut-turut dengan konsentrasi 70%, 80%, 96% dan 100% selama 1 jam dengan 2 kali pengulangan.
d. Clearing (Penjernihan)
Clearing dilakukan dengan merendam testis dalam Xylol selama 1 malam
e. Infiltrasi
Infiltrasi dilakukan dengan merendam testis dalam Xylol pada suhu 560 Celsius selama 1 jam di dalam inkubator. Dilanjutkan dengan merendam testis dalam Parafin cair bertingkat I, II dan III masing-masing pada suhu 560
f. Embedding (Penanaman)
selama 1 jam.
Embedding dilakukan dengan meletakkan testis pada cetakan yang telah
dipersiapkan sebelumnya, lalu dituangkan parafin cair ke dalam cetakan tersebut dan diberi label. Dibiarkan hingga mengeras dan terbentuk blok-blok parafin. Blok parafin tersebut ditempelkan pada holder kayu persegi yang telah dipersiapkan. g. Cutting (Pemotongan)
Blok parafin yang telah menempel pada holder kayu kemudian dipotong dengan mikrotom sehingga didapatkan pita-pita parafin.
h. Attaching (Penempelan)
Pita parafin yang didapat kemudian diletakkan pada objek glass dan direkatkan dengan cara dipanaskan di atas hotplate.
i. Pewarnaan
- Deparafinasi, yaitu melarutkan parafin dengan cara mencelupkan objek dalam Xylol selama 15 menit.
- Hidrasi dengan mencelupkan objek dalam Alkohol 100%, 96%, 80% dan 70% secara berturutan.
- Pewarnaan, dilakukan dengan merendam objek dalam larutan pewarna Hematoxylin selama 3-7 menit, lalu dibilas dengan air mengalir selama 10 menit. Dilanjutkan dengan mencelupkan objek dalam Alkohol 30% dan 50% kemudian direndam dalam pewarna Eosin 0,5% selama 3 menit kemudian dibilas dengan air mengalir. Lalu objek dicelupkan dalam Alkohol bertingkat mulai 70%, 80%, 96% hingga 100% masing-masing selama 1 menit. Kemudian objek dikeringkan dan dicelupkan dalam Xylol.
j. Mounting
Sediaan yang telah diwarnai kemudian ditutup dengan canada balsam.