BAHAN DAN METODE
3.3 Prosedur Penelitian .1 Hewan Percobaan
Penelitian ini menggunakan mencit jantan (Mus musculus L.) strain DDW dengan berat rata-rata 25 g umur 8-12 minggu sebanyak 30 ekor dan dibagi dalam 6
kelompok (kontrol dan perlakuan). Mencit diberi makan dan minum secara ad libitum (Smith & Mangkoewidjojo, 1988). Kandang mencit dijaga kebersihan dan kenyamanannya. Penanganan terhadap hewan percobaan berpedoman pada prinsip-prinsip penelitian kesehatan yang menggunakan hewan secara etis, prosedur dan standar yang dibuktikan dengan Ethical Clearance dan Komite Etik Penelitian Hewan, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara ( Lampiran E).
3.3.2 Rancangan Percobaan
Penelitian ini mengikuti desain Rancangan Acak Lengkap (RAL). Sebanyak 30 ekor mencit jantan (Mus Muculus L.) dibagi atas 6 kelompok perlakuan dan setiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit. Adapun penentuan jumlah ulangan dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) untuk setiap kelompok ditentukan dengan menggunakan rumus Federer (Chairul et al.,1992) yaitu:
(t - 1) (n - 1) ≥ 15
dimana : t adalah jumlah perlakuan n adalah jumlah ulangan
3.3.3 Pembuatan Bahan Uji
Dosis MSG yang diberikan untuk setiap mencit yaitu 4 mg/g BB (Simanjuntak, 2010). Setiap mencit memiliki berat rata-rata 25 g. Dosis MSG yang diberikan untuk setiap mencit yaitu 4 mg/g x 25 mg = 100 mg. Serbuk MSG ditimbang sebanyak 100 mg, setelah itu dilarutkan di dalam akuades sebanyak 0,2 ml dan diperoleh larutan MSG.
Vitamin C diberikan dengan dosis 0,26 mg/g BB untuk setiap mencit (Simanjuntak, 2010). Maka dosis vitamin C yang diberikan untuk setiap mencit dengan berat rata-rata 25 g yaitu 0,26 mg/g x 25 g = 6,5 mg. Serbuk vitamin C ditimbang sebanyak 6,5 mg setelah itu dilarutkan dalam akuades 0,2 ml dan diperoleh larutan vitamin C.
Vitamin E diberikan dengan dosis 0,026 mg/g BB untuk setiap mencit (Anggraini, 2006). Maka untuk setiap mencit dengan berat rata-rata 25 g dosis vitamin E yang diberikan yaitu 0,026 mg/g x 25 g = 0,52 mg. Larutan vitamin E murni ditimbang sebanyak 0,52 mg setelah itu dilarutkan ke dalam minyak jarak sebanyak 0,3 ml dan diperoleh larutan vitamin E.
3.3.4 Pemberian Perlakuan
Pemberian bahan uji dilakukan pada mencit jantan (Mus musculus L.) dengan menggunakan jarum gavage. Perlakuan diberikan selama 30 hari. Larutan MSG dan vitamin C diberikan dengan volume pemberian sebanyak 0,2 ml sedangkan untuk vitamin E dan minyak jarak masing-masing diberikan sebanyak 0,3 ml. Setelah pemberian perlakuan selesai kemudian mencit dibunuh dengan cara dislokasi leher. Selanjutnya mencit dibedah, diambil organ hepar dan dicuci dalam larutan fisiologis (NaCl 0,9%) kemudian ditimbang dengan menggunakan timbangan digital, setelah itu dimasukkan ke dalam larutan Bouin.
3.3.5 Kelompok Perlakuan
Adapun kelompok perlakuan dibagi atas 6 kelompok. Setiap kelompok terdiri atas 5 ekor mencit jantan dan diberi perlakuan selama 30 hari. Pemberian perlakuan untuk setiap kelompok dapat dilihat pada Tabel 3.3.5.
Tabel 3.3.5 Pemberian Perlakuan Terhadap Hewan Uji
Perlakuan Minyak Jarak
0,3 ml MSG 4 mg/g BB Vit C 0,26 mg/g BB Vit E 0,026 mg/g BB K - - - - - K+ √ - - - P1 - √ - - P2 - √ √ - P3 √ √ - √ P4 √ √ √ √
Keterangan : √ = diberi perlakuan
3.3.6 Pembuatan Preparat Histologis Hepar Mencit dengan Metode Parafin
(Suntoro, 1983).
Setelah dilakukan pembedahan pada mencit, organ hepar diambil, dicuci dalam larutan NaCl 0,9% lalu difiltrasi di dalam larutan bouin selama 1 malam. Setelah filtrasi selesai, organ hepar dicuci (washing) di dalam alkohol 70% dan digoyangkan terus-menerus (shaker) sampai alkohol berwarna cukup jernih. Kemudian dilanjutkan ke tahap dehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat masing-masing selama 1 jam dan digoyangkan terus-menerus (shaker). Setelah dehidrasi selesai dilanjutkan dengan penjernihan (clearing) menggunakan perbandingan alkohol : xylol (3:1, 1:1, 1:3) masing-masing selama 1 jam dan setelah itu organ hepar direndam dalam xylol murni selama 1 malam. Selanjutnya masuk ke tahap infiltrasi yang dilakukan di dalam oven dengan suhu 56°C, organ hepar direndam dalam larutan perbandingan xylol : parafin (3:1, 1:1, 1:3) dan berakhir di parafin murni masing-masing selama 1 jam.
Setelah tahap infiltrasi selesai dilakukan maka dilanjutkan dengan menanam (embedding) organ hepar dalam parafin yang telah dituang ke dalam kotak-kotak kecil dan dibiarkan selama 2 hari hingga terbentuk blok-blok parafin. Selanjutnya blok parafin dikeluarkan dari kotak-kotak dan ditempelkan pada holder yang terbuat dari kayu berukuran 2x2 cm dan dibiarkan selama 1 malam agar menempel pada holder. Selanjutnya dilakukan pemotongan (sectioning) blok parafin menggunakan mikrotom dengan ketebalan 6µm dan diperoleh pita-pita parafin. Setelah itu pita-pita parafin ditempelkan (affiksing) pada object glass yang sebelumnya telah dicelupkan ke dalam air dingin (biasa) kemudian air panas.
Pewarnaan (staining) dilakukan dengan menggunakan pewarna Hematoxilin-Eosin yang sebelumnya pita parafin telah dideparafinasi ke dalam xylol selama kira-kira 15 menit dan didealkoholisasi menggunakan alkohol konsentrasi menurun. Pita parafin dimasukkan ke dalam pewarna Hematoxilin erlich selama 3-7 menit lalu ke dalam alkohol 30%, 50%, dimasukkan ke dalam pewarna Eosin 0,5% dalam alkohol 70% selama 1-3 menit, selanjutnya preparat dimasukkan berturut-turut ke dalam alkohol dengan konsentrasi meningkat dan selanjutnya ke dalam xylol. Preparat histologis hepar dikeringkan dengan kertas penghisap. Preparat ditetesi dengan
canada balsam setelah itu ditutup dengan cover glass lalu diberi label sesuai dengan perlakuan masing-masing mencit.
3.3.7 Parameter Pengamatan 3.3.7.1 Pengamatan Kuantitatif
a. Berat hepar
Setelah dilakukan pembedahan pada mencit, organ hepar diambil, dicuci dalam NaCl 0,9% kemudian ditimbang dengan menggunakan timbangan digital.
b. Kerusakan histologis hepar
Preparat histologis hepar diamati di bawah mikroskop video mikrometer dalam lima lapangan pandang yang berada di sekitar vena sentralis dengan perbesaran 40x10 kali. Setiap lapangan pandang dihitung 20 sel secara acak dan dinilai skor tiap sel hepatosit dengan model Scoring Histopathology Manja Roenigk. Dalam 1 preparat ditemukan 100 sel hepatosit (Desprinita, 2010). Jenis kerusakan hepar yang diamati meliputi nekrosis, degenerasi parenkimatosa, dan degenerasi hidropik (Keliat, 2011).
Tabel 3.3.7.1 Kriteria Penilaian Derajat Histopatologi Sel Hepar Model Scoring
Histopathology Manja Roenigk.
Tingkat Perubahan Nilai
Normal 1
Degenerasi parenkimatosa 2
Degenerasi hidropik 3
Nekrosis 4
Data yang diperoleh diolah dengan program komputer SPSS release 17. Pada setiap preparat dihitung nilai rerata skornya dengan cara mengalikan jumlah sel sesuai dengan kategorinya. Sehingga berdasarkan kriteria Tabel 3.3.7.1, maka skor minimal yang mungkin didapatkan adalah 100 jika semua sel hepatosit yang ditemukan dalam keadaan normal. Skor maksimal 400 jika semua sel hepatosit dalam keadaan nekrosis (Widyarini 2010).
3.3.7.2 Pengamatan Kualitatif
a. Warna hepar
Penilaian normal bila permukaan rata dan halus serta berwarna merah kecoklatan, sedangkan abnormal jika permukaan berupa jaringan ikat, kista kecil, permukaan yang benjol-benjol atau abses dan menunjukkan perubahan warna (Keliat, 2011).
