BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, HIPOTESIS
4.5. Prosedur Penelitian
Alat dan bahan yang digunakan adalah kandang tikus lengkap dengan wadah khusus penampung urin, timbangan analitik, botol berwarna gelap, kain kasa untuk menyaring ekstrak propolis, bak untuk merenangkan tikus, sarung tangan, jarum suntik
sonde, pinset, kit untuk pemeriksaan f2-isoprostan, box pendingin, buku tabel untuk mencatat data.
4.5.2. Pembuatan Ekstrak Propolis Dalam Air
1. Propolis mentah disimpan dalam freezer sehari sebelumnya agar mudah dibersihkan dari kotoran.
2. Propolis mentah yang sudah dibersihkan lalu ditimbang sebanyak 100 gram, demikian pula dengan aquabidest ditimbang sebanyak 900 gram.
3. Selanjutnya, aquabidest dan propolis dimasukkan ke dalam satu wadah, tutup rapat, wadah disimpan dalam tempat yang gelap dan hangat, selama 1 minggu, lalu kocok pelan-pelan. Pengocokan dilakukan sepuluh kali setiap harinya sampai satu minggu.
4. Setelah disimpan, cairan disaring dengan kertas filter, kain halus, atau kapas. Kain dibuat berlapis agar penyaringan lebih efektif. Lebih baik lagi jika ditambahkan saringan lagi di bawahnya. Sisa saringan pertama masih bisa diekstrak lagi melalui prosedur yang sama. Untuk mendapat hasil yang maksimal, satu hari sebelum proses penyaringan, campuran propolis disimpan dalam lemari es, dengan suhu dibawah 4oC, tetapi jangan sampai membeku. Sebaiknya, saringan juga dibersihkan sebelum digunakan.
5. Hasil penyaringan akan berupa cairan jernih, bebas dari pertikel, dan berwarna cokelat kehitaman. Simpan hasil penyaringan dalam botol bersih berwarna gelap dan hampa udara. Jika botol tidak berwarna gelap, letakkan saja botol di tempat
gelap, dingin, atau dibungkus dengan kain atau kertas, lalu jauhkan dari cahaya matahari.
4.5.3 Pemberian Dosis Propolis
Penghitungan dosis propolis pada penelitian berdasarkan konversi dosis propolis pada manusia yaitu 30 cc (Astuti and Widyarini, 2009). Jika rerata berat badan orang Indonesia 50 kg, sementara konversi penghitungan dosis dari manusia (70 kg) ke tikus adalah 0,018, maka pemberian propolis setiap kali pemberian adalah:
Ekstrak propolis air 1 cc = 1 gram Ekstrak propolis air 30 cc = 30 gram
Perhitungan konversi pada tikus = 0,018 x 70/50 x 30 = 0,756 gram Dosis yang diberikan untuk perlakuan II = 150/200 x 0,756 = 0,567=0,6 gram
Dosis yang diberikan untuk perlakuan I = ½ x 0,6 g = 0,3 gram
4.5.4 Pemilihan dan Pemeliharaan Hewan Uji
Pemilihan tikus putih (Rattus Novergicus) yang akan dijadikan sampel percobaan dengan cara memilih tikus putih (Rattus Novergicus) galur Wistar, jantan yang sehat, dan menimbang tikus dengan berat 150-200 gram. Adanya penyakit dalam hewan uji dapat menyebabkan hasil uji tidak dapat dipercaya. Dalam hubungannya dengan ini pemeliharaan hewan uji harus diperhatikan. Makanan yang memenuhi syarat untuk masing-masing jenis hewan uji merupakan faktor penting di samping lingkungan yang sehat, penggunaan insektisida dan sebagainya (Ngatidjan, 2006).
Prinsip kandang tikus laboratorium sama dengan kandang mencit laboratorium, tetapi kandang tikus perlu sedikit lebih besar. Semua jenis kandang digunakan dengan maksud sama yaitu dipakai untuk mengandangkan hewan untuk percobaan, untuk
menternakan, atau untuk hewan persediaan (hewan stok). Kandang harus cukup kuat, tidak mudah rusak, dan tahan disteril ulang dengan suhu mencapai 1200 C dan tahan disterilkan dengan bahan kimia. Kandang dibuat dari bahan yang baik dan mudah dibongkar, mudah dibersihkan, dan mudah dipasang lagi. Kandang harus tahan gigitan, hewan tidak mudah lepas, tapi hewan harus tampak jelas dari luar (Smith and Mangkoewidjojo, 1988).
4.5.5. Alur Penelitian
1. Memilih tikus putih (Rattus Novergicus) sebanyak 21 ekor tikus, yang akan dipergunakan dalam penelitian, yang memenuhi kriteria inklusi, yaitu: tikus putih (Rattus Novergicus) galur Wistar, berjenis kelamin jantan yang sehat, berusia 2-3 bulan, dengan berat badan 150-200 gram.
2. Sebelum penelitian dimulai, dilakukan adaptasi terhadap seluruh tikus putih (Rattus Novergicus) galur Wistar jantan selama tujuh hari. Satu kandang berisi 4-5 ekor tikus.
3. Pada hari ke delapan dilakukan pengambilan sampel urin terhadap seluruh tikus putih (Rattus Novergicus) galur Wistar, yang telah ditampung selama satu malam, untuk pemeriksaan kadar f2-isoprostan sebagai pre-test.
4. Lalu tikus putih (Rattus Novergicus) galur Wistar jantan dibagi menjadi tiga kelompok, untuk selanjutnya diberikan perlakuan selama tujuh hari. Kontrol (P0) dengan aquadest 1 cc , P1 diberikan 0,3 g ekstrak propolis air yang diencerkan dengan aquadest sampai menjadi 1 cc per ekor/hari, P2 diberikan
0,6 g ekstrak propolis air yang diencerkan dengan aquadest sampai menjadi 1 cc per ekor/hari.
5. Selama perlakuan selama tujuh hari seluruh kelompok tikus putih (Rattus Novergicus) galur Wistar diberikan aktivitas fisik maksimal dengan cara direnangkan hingga hampir tenggelam (kurang lebih selama 60 menit) satu jam sebelum pemberian ekstrak propolis (Abubakar, 2010).
6. Lalu tikus putih (Rattus Novergicus) galur Wistar jantan dikeringkan dengan handuk dan dijemur di bawah sinar matahari kurang lebih selama 15 menit, dilanjutkan dengan pengambilan sampel urin tikus putih (Rattus Novergicus) galur Wistar jantan untuk pemeriksaan kadar f2-isoprostan post test.
Cara pemberian ekstrak propolis air pada tikus putih (Rattus Novergicus) galur Wistar, yaitu dengan memegang tikus putih (Rattus Novergicus) galur Wistar jantan, dengan cara memegang leher bagian belakang dengan tangan kiri sedemikian rupa sehingga kulit itu terjepit ibu jari dan telunjuk. Ini diperkuat dengan jepitan pangkal ibu jari dengan ibu jari lainnya pada kulit punggung dan ekor dikait dengan kelingking tangan kiri tersebut (Ngatidjan, 2006).
Bahan uji diberikan peroral dengan sonde. Sonde dimasukkan dengan hati-hati kira-kira sampai di lambung. Setelah yakin jarum masuk ke dalam lambung dan tidak ke paru, barulah bahan uji di dalamnya dipompakan ke luar (Ngatidjan, 2006). Alur penelitian dapat dilihat pada gambar 4.2 di bawah ini.
Pre test
Post test
Gambar 4.2. Alur Penelitian
4.5.6. Evaluasi F2-isoprostan dalam Urin Tikus Wistar
Pemeriksaan kadar f2-isoprostan dilakukan dengan menggunakan 8-iso-PGF2α enzyme immunoassay kit (EIA) dari assay design, yang merupakan immunoassay yang kompetitif untuk penentuan kadar bebas f2-isoprostan dalam larutan biological. Kit tersebut menggunakan antibodi poliklonal terhadap f2-isoprostan untuk dapat mengikatnya dengan cara yang kompetitif yang terdapat dalam sampel atau dalam molekul alkaline phospatase yang memiliki f2-isoprostan yang secara kovalen melekat padanya.
Prosedur penggunaan kit:
Seluruh urin tikus wistar diperiksa kadar 8-iso-PGF2α
Kelompok Kontrol Perlakuan 1 ANALISIS DATA Perlakuan 2
Seluruh urin tikus wistar diperiksa kadar 8-iso-PGF2α
Tikus direnangkan sampai kelelahan dan 1jam kemudian diberikan plasebo 1cc, hal ini dilakukan setiap hari selama 1 Tikus direnangkan sampai kelelahan dan 1jam kemudian diberikan propolis 0,3 g yg diencerkan sampai menjadi 1cc, hal ini dilakukan Tikus direnangkan sampai kelelahan dan 1jam kemudian
diberikan propolis 0,6 g yang diencerkan sampai menjadi 1cc, hal ini dilakukan setiap hari
3. Pertama ditentukan penomoran sumur yang akan digunakan dengan berpedoman pada lembar assay layout.
4. Memasukkan dengan pipet 100 µL standar diluent (Assay Buffer atautissue Culture Media) ke dalam sumur NSB dan B0 (0 pg/ml standard ).
5. Memasukkan dengan pipet100 µL cairan standar ke dalam sumur nomor satu sampai dengan tujuh.
6. Memasukkan dengan pipet 100 µL cairan sampel ke dalam sumur sesuai penomorannya.
7. Memasukkan dengan pipet 50 µL assay buffer ke dalam sumur NSB.
8. Memasukkan dengan pipet 50 µL konjugat biru ke dalam semua sumur, kecuali total activity (TA) dan sumur kosong (blank).
9. Memasukkan dengan pipet 50 µL antibodi kuning ke dalam semua sumur kecuali sumur kosong (blank), TA dan NSB. Sebagai catatan sesuai sumur harus berwarna hijau kecuali sumur NSB yang seharusnya berwarna biru. Sumur TA dan blank seharusnya kosong dan tidak berwarna pada langkah ini. 10. Piring sampel kit diinkubasi pada suhu kamar ke dalam plate shaker selama
dua jam pada 500 rpm, selama masa ini dapat digunakan plastik penutup piring sampel kit jika dikehendaki.
11. Masing-masing sumur dikosongkan dan dicuci dengan menambahkan 400 µL cairan pencuci, diulangi dua kali sehingga total dilakukan tiga kali pencucian. 12. Setelah pencucian terakhir, sumur dikosongkan dan piring ditepuk di atas
13. Ditambahkan 5 µL konjugat warna biru terang dalam pengenceran 1:10 ke dalam sumur TA.
14. Ditambahkan 200 µL cairan substrat kemudian diinkubasi dalam suhu kamar selama 45 menit tanpa dikocok.
15. Ditambahkan 50 µL stop solution ke dalam setiap sumur, hal ini akan segera menghentikan reaksi yang terjadi dan piring sampel harus segera dibaca setelahnya.
16. Kemudian dibaca dengan densitas optik pada 405 nm, dengan koreksi antara 570 dan 590 nm.