BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN
3.5 Metode Pelaksanaan Penelitian
3.5.3 Prosedur Penelitian
3.5.3.1Pembuatan Ekstrak Etanol Batang Siwak
Proses pembuatan ekstrak etanol siwak (Lampiran 2) dilakukan berdasarkan Standar Operasional Prosedur Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU dan panduan Farmakope Indonesia tahun 1995 dengan langkah-langkah sebagai berikut.
a. Pembuatan simplisia
Batang siwak dikeluarkan dari kemasannya dan ditimbang sebanyak 1 kg. Batang siwak kemudian dipotong kecil-kecil dan dikeringkan di dalam lemari pengering dengan suhu 40o selama 14 hari. Tanaman dikatakan sudah kering apabila batang siwak telah mudah dipatahkan. Batang siwak yang telah dikeringkan tersebut kemudian ditimbang kembali dan diperoleh 415 gram batang siwak yang telah kering. Selanjutnya batang siwak kering tersebut dimemarkan dengan alat penggiling tradisional dan dihaluskan dengan blender, dan didapat serat-serat halus batang siwak (simplisia).
b. Proses maserasi
Sebanyak 300 gram simplisia diletakkan ke dalam bejana tertutup dan dimaserasi dengan 1500 ml cairan penyari (etanol 70%) selama 15 menit dengan suhu 25oC.
c. Proses perkolasi
Setelah 24 jam, perkolator disiapkan dengan cara meletakkan kapas secukupnya pada bagian dasar wadah perkolator, kemudian di atas kapas tersebut diletakkan kertas saring sebanyak 2 lembar. Kemudian massa simplisia yang telah direndam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dengan hati-hati sambil sesekali ditekan dengan sendok dan di atasnya dilapisi selapis kertas saring. Kemudian etanol 70% dituangkan ke dalam perkolator dan massa disaring dengan lapisan kertas saring sampai cairan tersebut mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari untuk mengetahui apakah perkolator sudah berfungsi dengan baik. Kemudian perkolator ditutup dengan aluminium foil
dan dibiarkan selama 24 jam.
Setelah 24 jam, perkolator dibuka kembali dan cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit atau 20 tetes per menit. Tambahkan berulang-ulang cairan penyari (etanol 70%) secukupnya sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia (pada penelitian ini total etanol 70% yang dituangkan ke dalam simplisia adalah sebanyak 6 liter), hingga diperoleh ekstrak cair (jumlah ekstrak cair yang dihasilkan adalah sebanyak 5 liter).
d. Ekstrak cair diuapkan dengan vacuum rotavapor pada suhu 46o C selama 5 jam untuk 2,5 liter ekstrak cair per hari hingga konsistensi seperti madu. Ekstrak yang telah kental tersebut ditimbang dengan timbangan analitik.
e. Kemudian dibuat pengenceran dengan menggunakan MHB. Hasilnya didapat ekstrak senyawa aktif siwak 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Ekstrak etanol batang siwak dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup lalu disimpan di tempat yang sejuk.
Gambar 8. Bagian siwak yang diambil
Gambar 9. Penimbangan siwak Gambar 7. Batang siwak dalam
kemasan
Gambar 10. Pemotongan siwak Gambar 11. Pengeringan
siwak dalam lemari pengering
Gambar 14. Penghalusan siwak dengan blender Gambar 16. Perendaman simplisia Gambar 15. Simplisia siwak Gambar 17. Proses perkolasi siwak Gambar 12. Siwak yang telah
dikeringkan
Gambar 13. Siwak dimemarkan dengan alat penggiling tradisional
Gambar 18. Penguapan ekstrak cair
dengan vacuum rotavapor
3.5.3.2Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak batang siwak dalam etanol ditimbang menggunakan electronic balance dan massaya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth (MHB). Mula-mula dilarutkan 200 miligram ekstrak etanol kental batang siwak ke dalam 1 ml MHB untuk mendapatkan konsentrasi 20% ekstrak etanol batang siwak. Kemudian diambil setengah dari konsentrasi 20% dan dilarutkan dalam 1 ml MHB agar diperoleh konsentrasi 10%, dan seterusnya sampai didapat konsentrasi 1,25%. Masing-masing konsentrasi dimasukkan ke dalam tabung dan diberi label.
3.5.3.3Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Mueller Hinton Agar (MHA). Sebanyak 12 gram MHA dilarutkan dalam 240 ml akuades kemudian dituangkan ke dalam petri (20 ml/petri) lalu media disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121oC. Kemudian media dimasukkan ke dalm inkubator selama 24 jam untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau tidak. Jika steril, media sudah dapat digunakan untuk membiakkan specimen (Lampiran 3).
3.5.3.4Pembiakan Spesimen
E.faecalis yang digunakan adalah spesimen stem sel E. faecalis ATCC 29212 yang dibiakkan secara murni pada media MHA dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil beberapa koloni bakteri dengan ose steril lalu diencerkan dengan larutan NaCl 0,9% hingga konsentrasi 106 CFU/ml (CFU: Colony Forming Unit) atau setara dengan 0,5
Mc Farland Standard (Lampiran 3).
3.5.3.5Penentuan KHM Bahan Coba
Konsentrasi ekstrak etanol batang siwak yang diuji dalam penelitian ini adalah 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Dari masing-masing konsentrasi ekstrak etanol
batang siwak dari pengenceran yang telah dilakukan tersebut, diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba tersebut kemudian dicampur dengan vortex, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam pada inkubator CO2. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi dengan bantuan spektrofotometer, lalu dibandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM.
3.5.3.6Penentuan KBM Bahan Coba
Penentuan KBM bahan coba dilakukan dengan melakukan penghitungan jumlah koloni menggunakan metode Drop Plates Miles Mesra yaitu ekstrak etanol batang siwak 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Setelah diinkubasi pada prosedur penentuan KHM, bahan coba dengan konsentrasi seperti di atas dicampur dengan
vortex dan diambil 50 µl dengan mikropipet untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam MHA (Lampiran 4), dilakukan 5 kali replikasi, diamkan selama 15-20 menit. Setelah mengering diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 24 jam. Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri (Lampiran 5). Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil standar (CFU/ml). Contoh cara penghitungan koloni bakteri pada bahan coba dengan metode Drop Plate Miles Mesra adalah:
a. Ambil 50 µl bahan coba dengan mikropipet dan diteteskan pada MHA. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh pada media dihitung.
b. Jika tetesan berjumlah 5 koloni, maka jumlah kuman pada sampel cair tersebut adalah 5 x 1 (faktor pengenceran) x 20 (faktor pengali) = 100 CFU/ml.