METODE PENELITIAN
4.5 Prosedur Penelitian
4.5.1 Persiapan Ekstrak n-Heksana, Ekstrak Kloroform, dan Ekstrak
Etanol 96% Daun Acalypha indica L.
A. Pembuatan Simplisia Daun Acalypha indica L.
1. Daun Acalypha indica L. yang telah dipanen disortasi basah, dibilas air untuk membersihkan dari pengotor hingga bersih kemudian ditimbang beratnya.
2. Kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan
sampai kering. Setelah kering, dilakukan sortasi kering dan ditimbang beratnya.
3. Simplisia diserbuk dengan menggunakan blender dan
diayak dengan derajat ayakan nomor 40. Selanjutnya ditimbang beratnya.
B. Pembuatan Ekstrak n-Heksana, Ekstrak Kloroform, dan
Ekstrak Etanol 96% Daun Acalypha indica L. secara
1. Serbuk simplisia ditimbang 50 gram kemudian direndam dalam pelarut n-heksana 250 ml dalam wadah tertutup dan didiamkan selama 1 hari dengan pengadukan setiap beberapa menit. Setelah itu, dilakukan penyaringan dengan corong Buchner yang telah dihubungkan dengan pompa vakum untuk mendapatkan filtratnya. Serbuk simplisia diambil kemudian direndam kembali dengan pelarut yang sama sebanyak 250 ml dalam wadah tertutup selama 1 hari. Maserasi diulang hingga tiga kali perendaman dengan pelarut yang sama. Selanjutnya, filtrat yang telah didapat dari tiga kali re-maserasi dipekatkan dengan rotavapor dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 40°C hingga diperoleh berat ekstrak stabil. 2. 50 mg residu serbuk simplisia yang telah kering kemudian direndam dalam pelarut kloroform 250 ml dalam wadah tertutup dan didiamkan selama 1 hari dengan pengadukan setiap beberapa menit. Setelah itu, dilakukan penyaringan dengan corong Buchner yang telah dihubungkan dengan pompa vakum untuk mendapatkan filtratnya. Serbuk simplisia diambil kemudian direndam kembali dengan pelarut yang sama sebanyak 250 ml dalam wadah tertutup selama 1 hari. Maserasi diulang hingga tiga kali perendaman dengan pelarut yang sama. Selanjutnya, filtrat yang telah didapat dari tiga kali re-maserasi dipekatkan dengan rotavapor dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 40°C hingga diperoleh berat ekstrak stabil.
3. 50 mg residu serbuk simplisia yang telah kering kemudian direndam dalam pelarut etanol 96% 250 ml dalam wadah tertutup dan didiamkan selama 1 hari dengan pengadukan setiap beberapa menit. Setelah itu, dilakukan penyaringan dengan corong Buchner yang telah dihubungkan dengan pompa vakum untuk mendapatkan filtratnya. Serbuk simplisia diambil kemudian direndam kembali dengan pelarut yang sama sebanyak 250 ml dalam wadah tertutup selama 1 hari. Maserasi diulang hingga tiga kali perendaman dengan pelarut yang sama. Selanjutnya, filtrat yang telah didapat dari tiga kali re-maserasi dipekatkan dengan rotavapor dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 40°C hingga diperoleh berat ekstrak stabil.
4.5.2 Prosedur Pembiakan Plasmodium falciparum
I. Pembuatan Media Biakan
Media yang digunakan untuk pembiakan P. falciparum
secara in vitro terdiri dari media tak lengkap dan media lengkap.
A. Pembuatan media tak lengkap sebanyak 1 L
1. Beaker glass yang berisi HEPES 5,94 gram dan
hipoksantin 50 mg ditambah air steril. Diaduk dan dicampur sampai larut dan homogen selama 1 jam dengan menggunakan pengaduk magnetis. 2. Ditambahkan 1 sachet serbuk RPMI berisi 10,4 gram. Sachet RPMI dibilas perlahan dengan air steril selama beberapa kali.
3. Ditambahkan air steril sampai dengan volume 1 liter dan dicampur sampai homogen.
4. Ditambahkan NaHCO3 sebanyak 2 gram dan
diaduk hingga larut.
5. Dimasukkan Gentamisin 25 mg dan diaduk
sampai larut.
6. Disterilisasi dengan cara disaring menggunakan
membran micropore 0,22 μm, kemudian
disimpan dalam botol steril pada suhu 40°C.
B. Pembuatan media lengkap sebanyak 50 mL
1. Dimasukkan 42,5 ml media tak lengkap ke dalam
tabung falcon bertutup 50 mL yang telah disterilkan terlebih dahulu.
2. Ditambahkan plasma yang telah dipreparasi
sebanyak 7,5 ml, dikocok dengan perlahan sampai tercampur rata sehingga diperoleh media dengan kadar palsma sebesar 15%. Media ini
digunakan untuk membiakkan P. falciparum.
II. Preparasi Eritrosit dan Plasma Segar Manusia
A. Preparasi Eritrosit 50%
1. Diambil 7,5 ml darah, kemudian dimasukkan ke
dalam tabung falcon bertutup yang telah disterilkan.
2. Darah pada tabung falcon dicuci dengan media lengkap dengan cara menambahkan 7,5 ml media lengkap kemudian dilakukan proses sentrifuge pada kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Proses ini diulang sebanyak tiga kali.
3. Darah yang telah dicuci dicampur kembali dengan media lengkap dengan volume yang sama sehingga kandungan eritrosit menjadi 50% dan disebut RBC 50%.
B. Preparasi Plasma Segar Manusia
1. Plasma diaktivasi dengan menginkubasi pada
suhu 56°C selama 30 menit.
2. Plasma yang telah diaktivasi kemudian diambil sejumlah 15 ml dan dimasukkan ke dalam tabung falcon bertutup.
3. Dilakukan sentrifuge pada 1500 rpm selama 5
menit untuk mengendapkan fibrin pada plasma.
4.5.3 Kultivasi Plasmodium falciparum
A. Prosedur Pencairan (Thawing)
1. Parasit beku P. falciparum dihangatkan di dalam
inkubator pada suhu 37°C selama 15 menit sampai mencair.
2. Parasit yang telah mencair disuspensi dengan 2 ml NaCl 3,5% menggunakan mikropipet, lalu dimasukkan dalam tabung falcon steril bertutup 15 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Kemudian supernatan yang didapat dibuang.
3. Parasit dicuci dengan medium tak lengkap kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit. Setelah itu, bagian supernatan dibuang. Proses ini diulangi dua kali.
4. Parasit kemudian ditambahkan 4 ml media lengkap dan 1 ml RBC 50%, dicampur sampai homogen dengan menggunakan pipet.
5. Suspensi parasit kemudian ditambahkan dalam cawan
petri, kemudian diberi label tanggal, bulan, tahun, kadar hematokrit,dan tipe strain parasit.
6. Biakan kemudian dimasukkan ke dalam bejana
eksikator yang telah berisi lilin. Lilin dinyalakan kemudian eksikator ditutup rapat. Setelah lilin mati, eksikator dimasukkan ke dalam inkubator dan diinkubasi pada suhu 37°C. Media biakan diganti dengan media yang baru setiap 24 jam.
B. Prosedur Penggantian Media
1. Diambil larutan media lengkap pada cawan petri
yang berisi biakan parasit dengan cara dipipet sebanyak mungkin.
2. Ditambahkan media lengkap baru ke dalam biakan
dengan jumlah yang sama dengan yang telah diambil pada tahap (1). Kemudian dicampur hingga merata.
3. Biakan dimasukkan kembali ke dalam candle jar dan
diinkubasi pada suhu 37°C.
C. Subkultur
Tujuan subkultur adalah untuk menurunkan kadar parasitemia yang tinggi menjadi lebih rendah sesuai yang diinginkan. Biakan yang telah mencapai kadar parasitemia yang tinggi harus diencerkan dan dipindahkan ke tempat pembiakan yang baru untuk dibiakkan lebih lanjut. Kadar parasitemia awal dibuat sekitar 0,1-0,2% dengan cara
mengencerkan menggunakan RBC 50% hematokrit. Setelah diencerkan, dibuat sediaan hapusan darah tipis untuk menghitung jumlah parasitemianya. Sediaan kemudian diinkubasi kembali dalam inkubator pada suhu 37°C.
4.5.4 Pengamatan Pertumbuhan P. falciparum
A. Pembuatan Sediaan Hapusan Darah Tipis
1. Diteteskan kurang lebih 1 tetes suspensi sel parasit pada gelas objek, lalu dengan bantuan satu sisi cover
glass, supensi sel parasit tersebut diratakan.
Kemudian dibiarkan di udara terbuka hingga kering.
2. Dilakukan fiksasi hapusan darah tipis tersebut dalam
metanol absolut, kemudian diletakkan dalam udara terbuka hingga metanol kering.
3. Pewarna Giemsa 20% dalam aquadest diteteskan
pada hapusan darah tipis hingga menutupi seluruh permukaan hapusan darah, kemudian dibiarkan selama 20 menit lalu dicuci dengan air dan dibiarkan di udara terbuka hingga kering.
4. Setelah sediaan kering, hapusan diperiksa dengan
mikroskop pada perbesaran 10 x 100 untuk menghitung parasitemia.
4.5.5 Pengujian Aktivitas Antimalaria
A. Preparasi Suspensi Sel Parasit Uji
Kadar parasitemia awal tiap well pada pengujian aktivitas antimalaria secara in vitro adalah 1% parasitemia dan 5% hematokrit. Dalam 1 plate terdapat 24 well.
1. Seluruh suspensi dalam petri (± 5 mL) dimasukkan tabung falcon steril bertutup 15 ml kemudian disentrifugasi 1500 rpm selama 5 menit. Sebanyak 4,5 ml supernatan dibuang sehingga diperkirakan terdapat 5% sel darah merah terinfeksi parasit dan 50% hematokrit dengan jumlah total ± 500 μL.
2. Dibuat suspensi sel parasit agar kandungan
parasitemia menjadi 1% dan hematokrit menjadi 10%, dengan menambahkan larutan RBC 50% sebanyak 2000 μL ke dalam tabung, kemudian ditambahkan larutan media lengkap sebanyak 10,0 ml, kemudian suspensi tersebut dicampur dengan hati-hati menggunakan mikropipet hingga tercampur rata.
3. Sebelum dimasukkan ke dalam microwell, dibuat
hapusan darah tipis sebagai D0, yaitu kadar parasitemia awal pada jam ke-0 sebelum diberi zat uji.
4. Dimasukkan sebanyak 500 μL suspensi sel parasit ke
dalam masing-masing well yang sudah berisi 500 μL
larutan uji. Volume suspensi sel dibuat cukup untuk 24 well.
B. Preparasi Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak n-heksana, ekstrak kloroform, dan ekstrak etanol
96% daun Acalypha indica L. Masing-masing sampel
dibuat dengan konsentrasi 100; 10; 1; 0,1; dan 0,01 ppm. Prosedur preparasi sampel adalah sebagai berikut:
1. Masing-masing ekstrak ditimbang sejumlah 10 mg,
lalu dilarutkan dalam 100 μL DMSO (dimetil sulfoksida) sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 100000 μg/mL .
2. Larutan baku induk 100000 μg/ml dipipet sebanyak 10 μL, kemudian ditambah 490 μL media lengkap sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 2000 μg/mL.
3. Larutan baku induk 2000 μg/ml dipipet sebanyak 120
μL dan dimasukkan ke dalam microwell. Kemudian ditambahkan 1080 μL media lengkap sehingga didapatkan larutan dengan konsentrasi 200 μg/mL. Selanjutnya dilakukan duplikasi dengan cara memipet 500 μL larutan 200 μg/mL tersebut, lalu
dimasukkan ke well di bawahnya dan masing-masing
well kemudian ditambah 500 μL suspensi parasit. Selanjutnya larutan tersebut disebut dengan D1 dengan konsentrasi 100 μg/mL.
4. Larutan baku induk 200 μg/ml dipipet sebanyak 120
μL lalu dimasukkan ke microwell. Kemudian
ditambah 1080 μL media lengkap (20 μg/ml). Selanjutnya dilakukan duplikasi dengan cara
memipet 500 μL larutan 20 μg/mL tersebut, lalu
dimasukkan ke well di bawahnya dan masing-masing
well kemudian ditambah 500 μL suspensi parasit. Selanjutnya larutan tersebut disebut dengan D2 dengan konsentrasi 10 μg/mL.
5. Larutan baku 20 μg/mL dipipet sebanyak 120 μL lalu
dimasukkan ke microwell. Kemudian ditambah 1080
μL media lengkap (2 μg/mL). Selanjutnya dilakukan duplikasi dengan cara memipet 500 μL larutan 2 μg/mL tersebut, lalu dimasukkan ke well di
bawahnya dan masing-masing well di bawahnya dan
masing-masing well kemudian ditambah 500 μL
suspensi parasit. Selanjutnya larutan disebut dengan D3 dengan konsentrasi 1 μg/mL.
6. Larutan baku 2 μg/mL dipipet sebanyak 120 μL lalu
dimasukkan ke microwell. Kemudian ditambah 1080
μL media lengkap (0,2 μg/mL). Selanjutnya dilakukan duplikasi dengan cara memipet 500 μL
larutan 0,2 μg/mL tersebut, lalu dimasukkan ke well
di bawahnya. Masing-masing well kemudian
ditambah 500 μL suspensi parasit. Selanjutnya larutan tersebut disebut dengan D4 dengan konsentrasi 0,1 μg/mL.
7. Larutan baku 0,2 μg/mL dipipet sebanyak 120 μL
lalu dimasukkan ke microwell. Kemudian ditambah 1080 μL media lengkap (0,02 μg/mL). Selanjutnya dilakukan duplikasi dengan cara memipet 500 μL larutan 0, 02 μg/mL tersebut, lalu dimasukkan ke well
di bawahnya. Masing-masing well kemudian ditambah 500 μL suspensi parasit. Selanjutnya larutan tersebut disebut dengan D5 dengan konsentrasi 0,01 μg/mL.
C. Pembuatan Larutan Kontrol Negatif
1. Memipet 10 μL larutan DMSO kemudian ditambah
490 μL media lengkap.
2. Memipet 100 μL dari larutan (1) kemudian ditambah
900 μL media lengkap (setara dengan konsentrasi D2 (10 μg/mL)).
3. Larutan (2) dipipet sebanyak 120 μL dan dimasukkan
ke dalam microwell. Kemudian ditambahkan 1080 μL
media lengkap. Selanjutnya dilakukan duplikasi dengan cara memipet 500 μL larutan tersebut, lalu
dimasukkan ke well di bawahnya dan masing-masing
well kemudian ditambah 500 μL suspensi parasit.
D. Preparasi Lempeng Sumur Mikro
Uji aktivitas antimalaria pada penelitian ini dilakukan dalam microwell plate disposable yang steril. Microwell terdiri dari 24 well dengan 6 baris (A-F) dan 4 kolom (1-4) yang diberi larutan uji dan kontrol negatif.
Gambar 4.2 Denah microwell plate Keterangan:
Kolom A Baris 1-4 = D1 = Larutan ekstrak 100 μg/mL Kolom B Baris 1-4 = D2 = Larutan ekstrak 10 μg/mL Kolom C Baris 1-4 = D3 = Larutan ekstrak 1 μg/mL Kolom D Baris 1-4 = D4 = Larutan ekstrak 0,1 μg/mL Kolom E Baris 1-4 = D5 = Larutan ekstrak 0,01 μg/mL Kolom F Baris 1-4 = K- = Kontrol negatif
A
1 2 3 4
B
C
D
E
F
Pada penelitian ini digunakan dua buah microwell. Microwell pertama pada kolom 1 dan 2 diisi larutan uji ekstrak n-heksana, sedangkan kolom 3 dan 4 diisi larutan uji ekstrak kloroform. Larutan uji ekstrak etanol diisikan pada dua kolom
yang terdapat pada microwell kedua.
Masing-masing konsentrasi dilakukan sebanyak dua kali. Microwell yang telah diisi larutan uji dan suspensi parasit selanjutnya dimasukkan dalam candle jar dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C. 4.5.6 Pengamatan Hasil
1. Setelah 48 jam, kira-kira 950 μL bagian atas suspensi dalam microwell dibuang, kemudian dibuat sediaan hapusan darah tipis.
2. Sediaan hapusan darah tipis diwarnai dengan Giemsa 20% dengan metode yang sama seperti pada 4.5.4.A.
3. Setelah kering, hapusan darah tipis kemudian diperiksa dengan menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 x 100.
4. Pengamatan dilakukan dengan menghitung persentase parasitemia seperti pada 4.5.7.
4.5.7 Pengolahan Data
A. Perhitungan Persentase Parasitemia
Persen parasitemia diperoleh dengan cara menghitung jumlah eritrosit terinfeksi parasit malaria dalam 5000 eritrosit yang diamati dikalikan 100%.
B. Perhitungan Persentase Pertumbuhan
Persen pertumbuhan diperoleh dengan cara sebagai berikut:
Keterangan:
D0 = persen parasitemia sebelum dilakukan uji
C. Perhitungan Persentase Penghambatan
Keterangan:
Xu = persen pertumbuhan larutan uji
Xk = persen pertumbuhan pada kontrol negatif
D. Perhitungan IC50
IC50 merupakan konsentrasi sampel yang dapat
menghambat pertumbuhan parasit sebanyak 50%.
Perhitungan IC50 dilakukan dengan menggunakan analisis
Probit (probability unit) yaitu dengan membuat kurva hubungan antara probit persen penghambatan dengan Persen Pertumbuhan = Persen parasitemia tiap konsentrasi uji
– Rerata persen parasitemia D0
Persen Parasitemia = X 100%
logaritma konsentrasi sampel menggunakan persamaan garis regresi linier.
4.5.8 Skrining Fitokimia
A. Skrining untuk Golongan Terpenoid
1. Sedikit ekstrak ditambah beberapa tetes n-heksana, diaduk sampai larut, kemudian ditotolkan pada fase diam.
2. Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan:
Fase diam : Kiesel gel GF 254
Fase gerak : n-heksana – etil asetat (4 : 1)
Penampak noda : Pereaksi anisaldehida asam sulfat 3. Adanya terpenoid atau steroid ditunjukkan dengan
terjadinya warna merah ungu atau ungu. (Anonim, 2013)
B. Skrining untuk Golongan Polifenol dan Tanin
1. 0,3 gram ekstrak ditambah dengan 10 ml akuades
panas, kemudian diaduk dan dibiarkan sampai mencapai suhu kamar, lalu ditambahkan 3-4 tetes 10% NaCl, kemudian diaduk, setelah itu disaring.
2. Uji kromatografi lapis tipis ini menggunakan:
Fase diam : Kiesel gel GF 254
Fase gerak : Kloroform: etil asetat : asam formiat (0,5 : 9 : 0,5)
Penampak noda : Pereaksi FeCl3
Jika timbul warna hitam menunjukkan adanya polifenol dalam sampel. (Anonim, 2013)
1. Larutan preparasi sampel (1) ± 3 ml digunakan sebagai blanko dan ± 3 ml ditambah dengan sedikit larutan gelatin dan 5 ml larutan NaCl 10%.
2. Jika terjadi endapan putih menunjukkan
adanya tannin. (Anonim, 2013).
b. Uji Ferriklorida
1. Larutan preparasi sampel (1) ± 3 ml diberi beberapa tetes larutan FeCl3, kemudian diamati terjadinya perubahan warna.
2. Jika terjadi perubahan warna hijau
kehitaman menunjukkan adanya tanin. (Anonim, 2013)
C. Skrining untuk golongan Alkaloid
1. Ekstrak sebanyak 0,3 gram ditambah 2 ml etanol 96%, diaduk sampai larut, lalu ditambah 5 ml HCl 2N dan dipanaskan di atas penangas air selama 2-3 menit sambil diaduk.
2. Setelah dingin, ditambah 0,3 gram NaCl, diaduk rata, kemudian disaring. Filtrat ditambah 5 ml HCl 2N.
3. Kemudian ditambahkan NH4OH pekat sampai larutan
menjadi basa, kemudian diekstraksi dengan 5 ml kloroform bebas air.
4. Fase kloroform (bagian bawah) diambil dengan memakai pipet, dikumpulkan dalam cawan kemudian diuapkan di lemari asam. Selanjutnya siap untuk pemeriksaan dengan uji KLT
Fase gerak : Kloroform – etil asetat (1 : 1) Penampak noda : Pereaksi Dragendorf
4. Jika timbul warna jingga maka menunjukkan adanya
BAB V