METODE PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1.Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah buah tumbuhan Harimonting yang diperoleh dari daerah Tambunan Baruara, Kabupaten Toba Samosir, Sumatera Utara. Buah tumbuhan Harimonting dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk sebanyak 1500 gram.
3.3.2. Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Buah Tumbuhan Harimonting
Serbuk buah tumbuhan Harimonting diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Uji Busa
2. Skrining Fitokimia
3.3.2.1.Uji Busa
Serbuk buah tumbuhan Harimonting sebanyak 1500 g dimaserasi dengan metanol, kemudian sebanyak 5ml ekstrak methanol dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 10 ml aquadest dan dipanaskan pada penangas air. Lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 10 menit. Ternyata busa hilang yang membuktikan bahwa di dalam buah tumbuhan Harimonting tidak terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2. Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoid pada buah tumbuhan Harimonting, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif. Serbuk buah tumbuhan Harimonting diekstraksi maserasi dengan metanol, dikeringkan. Filtrat yang diperoleh ditambahkan pereaksi H2SO4(p), NaOH 10%, FeCl3 5% dan Mg-HCl, terjadilah perubahan warna pada setiap penambahan pereaksi yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid.
3.3.2.3. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-Heksana : Etil Asetat dengan perbandingan (90 : 10)v/v ; (80 : 20)v/v; (70: 30)v/v; (60 : 40)v/v ; (50 : 50)v/v.
Prosedur analisis kromatografi lapis tipis :
Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90 : 10) v/v ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan. Diamati warna bercak yang timbul dibawah sinar Ultra Violet dengan λ= 254 nm dan dihitung harga Rf yang
diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-Heksana : Etil asetat (80 : 20)v/v;(70:30)v/v;(60:40)v/v;(50:50)v/v. Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam buah tumbuhan Harimonting terkandung senyawa flavonoid. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak n-Heksana:Etil asetat(80:20)v/v.
Harga Rf dapat dilihat pada kromatogram (Lampiran 3).
3.3.3. Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak Buah Tumbuhan Harimonting
Serbuk buah tumbuhan Harimonting ditimbang sebanyak 1500 g, dimasukkan ke dalam bejana dan ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama 48 jam dan sesekali diaduk. Maserat disaring dan diperoleh ekstrak berwarna hijau. Maserasi dilakukan berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol sampai ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa flavonoid. Ekstrak metanol yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotari evaporator pada suhu 600C sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol, kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksan, sehingga terbentuk lapisan n-heksan dan lapisan metanol. Fraksi metanol ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan rotarievaporator, sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 10,23 gram.
3.3.4. Isolasi Senyawa Flavonoid dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoid secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol buah tumbuhan Harimonting yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60 G dan fasa gerak adalah campuran pelarut n-Heksana : etil
asetat dengan perbandingan (90: 10)v/v;(80:20)v/v;(70:30)v/v(60:40)v/v;(50:50)v/v.
Dirangkai seperangkat alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 G dengan menggunakan n-Heksan, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-Heksan 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 10,23 g ekstrak pekat buah tumbuhan Harimonting ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel di puncak kolom, lalu ditambahkan fasa gerak n-Heksana : etil asetat dengan perbandingan (90: 10)v/v;(80:20)v/v;(70:30)v/v(60:40)v/v;(50:50)v/v secara perlahan-lahan dan diatur aliran fasa gerak yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas kolom. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama. Setelah itu diuji flavonoid dan diuapkan sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal.
3.3.5. Pemurnian
Senyawa yang diperoleh dari fraksi yaitu pada fraksi 41-80 dilakukan pemurnian senyawa. Senyawa pada fraksi 41-80 dilarutkan dengan etil asetat, sehingga pengotor pada amorf akan larut dan larutannya didekantasi kemudian disaring dan dimurnikan dilakukan secara berulang-ulang.
3.3.6. Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis(KLT)
Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak n-heksana : etil asetat (80:20)v/v.
Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis:
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya dilarutkan pada KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi Feri klorida
dalam air menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoid. Perlakuan yang sama dilakukan, dan difiksasi dengan Natrium Hidroksida dalam air yang menghasilkan bercak berwarna biru violet.
3.3.7. Analisis Spektroskopi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis Spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Laboratorium Dasar Bersama UNAIR Surabaya (Lampiran 5).
3.3.7.2. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Inframerah
Analisis spektrum inframerah dengan spektrofotometer dilakukan di Laboratorium Dasar Bersama UNAIR Surabaya (Lampiran 7).
3.3.7.3. Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Analisis ini dilakukan di Laboratorium Dasar Bersama UNAIR Surabaya dengan menggunakan CDCl3 sebagai pelarut dan TMS sebagai standart dalam spektrum absorbansi antara 0-14 ppm dibawah TMS (Lampiran 8).
3.5. Bagan Penelitian
← diskrining fitokimia
← dimaserasi dengan 6 L metanol selama ± 48 jam ← disaring ← dipekatkan dengan rotari evaporator ←dipartisi n-heksana
← diskrining fitokimia ← diskrining ← dipekatkan dengan rotari evaporator ← fitokimia
← di analisis KLT untuk menentukan eluen pada pemisahan kromatografi kolom ← dibuburkan sampel dengan silika gel
← dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan fasa diam silika gel 60 GE netral dan fasa gerak(eluen) n-heksana : etil asetat (90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 ; 50:50)v/v ← ditampung setiap fraksi sebanyak 5 ml dalam botol vial
← di KLT
← digabung fraksi dengan Rf yang sama
← diuji pereaksi ← diuji pereaksi ← diuji pereaksi ← diuji pereaksi ← diuji pereaksi
← diuapkan
←dimurnikan ← dianalisis KLT
← dianalisis dengan Spektrometer FT-IR, spektrometer 1 H-NMR,
Spektrofotometer UV-Visible 1500 g serbuk buah
Tumbuhan Harimonting
Residu Ekstrak Metanol sebanyak 4 L
Ekstrak pekat metanol sebanyak 2 L
Fraksi n-heksana 500 ml Fraksi metanol sebanyak 1,5 L
Ekstrak Pekat methanol sebanyak 10,23 g Hasil Negatif
Fraksi 1-20 Fraksi 21- 40 Fraksi 41-80 Fraksi 81-100 Fraksi 101-120
Hasil negatif Hasil positif Fraksi 41-80 Hasil positif Hasil negatif
senyawa
Senyawa murni