METODE PENELITIAN
3.4 Prosedur Penelitian
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pembuatan substrat koloidal kitin
Sebanyak 5 gram kitin yang diperoleh dari laboratorium Kimia Fisik, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga. Kitin dilarutkan dalam 100 ml HCl 10 N lalu didiamkan selama 24 jam pada suhu 4oC, kemudian larutan disaring. Adapun filtrat ditambahkan 50 ml akuades dingin dan 10 N NaOH
Uji aktivitas
Karakterisasi enzim kitinase
Optimasi fraksinasi aseton
Panen cairan disgestive gland Achatina fulica
Perlakuan terhadap Achatina fulica Karantina Achatina
Achatina fulica
Kitinase dengan kemurnian parsial
Ekstrak enzim dygestive gland
Achatina fulica
Penentuan kadar protein
Data uji aktivitas Data kadar
protein
Data uji aktivitas
Uji aktivitas Penentuan kadar protein
Data kadar protein fulica Suhu optimum enzim kitinase pH optimum enzim kitinase
hingga mencapai pH 7. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 20 menit hingga berbentuk koloid. Selanjutnya, koloid diresuspensi menggunakan akuades, disentrifugasi selama 15 menit dan disimpan pada suhu 4oC (Rochima, 2006).
3.4.2 Karantina Achatina fulica
Achatina fulica dikarantina dalam kandang yang tidak terkena sinar matahari langsung. Kelembaban kandang senantiasa dijaga dengan cara memberi air ke dalam kandang namun tidak terlalu banyak. Achatina fulica diberi makanan berupa dedaunan dan sayur setiap hari minimal selama satu minggu.
3.4.3 Panen cairan disgetive gland Achatina fulica
Cangkang bagian belakang Achatina fulica dipecah, lalu cairan yang keluar ditampung. Cairan digestive glandAchatina fulica yang sudah ditampung, disentrifugasi dengan kecepaatan 4000 rpm. Jika terdapat endapan dan supernatan, maka supernatan merupakan crude enzim Achatina fulica.
3.4.4 Pembuatan kurva standar koloidal kitin
Koloidal kitin yang sudah tersedia dilarutkan ke dalam bufer fosfat 50 mM pH 7. Larutan induk dibuat dari koloidal kitin 0,25 % b/v. Untuk kadar koloidal kitin selanjutnya dibuat dari pengenceran koloidal kitin induk.
3.4.5 Pembuatan kurva progres
Disiapkan enam tabung ependorf yang bersih. Ke dalam masing-masing tabung, dimasukkan sejumlah 200 μl enzim kitinase dan 800 μl substrat kitin. Masing-masing tabung diinkubasi dengan waktu yang berbeda. Pada tabung
pertama diinkubasi selama 10 menit, ke-dua diinkubasi 20 menit dan seterusnya hingga tabung ke-enam. Setelah diinkubasi, diukur OD (Optical Density) pada masing-masing sampel.
3.4.6 Optimasi fraksinasi aseton ekstrak kasar enzim kitinase
Fraksinasi aseton dilakukan pada kisaran prosentase 50 hingga 70. Fraksinasi pertama, ekstrak enzim kitinase sebanyak 20 ml ditambahkan 50% aseton, kemudian disentrifugasi, sehingga didapatkan residu fraksi 0-50% dan supernatan. Fraksinasi ke-dua, supernatan diambil dan ditambahkan aseton hingga 70%, kemudian disentrifugasi, sehingga didapatkan residu fraksi 50-70% dan supernatan.
Setiap endapan yang terbentuk pada masing-masing fraksi selanjutnya dilakukan pengukuran aktivitas unit dan aktivitas spesifik kitinase. Apabila dalam tahap fraksinasi ini belum terjadi pemisahan kitinase secara baik, yang ditandai dengan nilai aktivitas kitinase yang masih menyebar, maka perlu dilakukan optimasi variasi prosentase aseton pada prosedur fraksinasi.
3.4.7 Penentuan kadar protein
Penentuan kadar protein menggunakan metode Lowry. Disiapkan larutan A, B, C dan D. Larutan A dibuat dengan cara menimbang sebanayak 0,5 gram Cu.SO4.5H2O dan 1 gram Na3C6H5O7.7H2O, kemudian dilarutkan dalam akuades. Larutan tersebut diencerkan dalam labu ukur 100 ml dengan akuades. Larutan B dibuat dengan cara menimbang 20 gram Na2CO3 dan 4 gram NaOH, kemudian dilarutkan dalam akuades 1 liter. Larutan C dibuat dari 1 ml larutan A ditambah
dengan 50 ml larutan B. Sedangkan larutan D dibuat dari 10 ml reagen fenol Folin-Ciocalteu ditambah dengan 10 ml akuades.
Tahap pengukuran kadar protein dari enzim kitinase adalah, sebanyak 0,5 ml sampel enzim ditambah 2,5 ml larutan C. Hasil dari pencampuran keduanya divortex. Kemudian ditambah dengan 0,25 ml larutan D, setelah itu diinkubasi selama 20 menit, kemudian OD (Optical Density) dibaca pada λ750.
3.4.8 Uji aktivitas enzim kitinase setiap fraksi hasil fraksinasi aseton
Sejumlah 200 μl enzim kitinase ditambah dengan 800 μl substrat kitin (0,25% kolodial kitin b/v dalam 50 mM bufer fosfat pH 7). Campuran diinkubasi pada suhu 37oC selama 20 menit, kemudian dilakukan pengukuran aktivitas kitinase.
Larutan standar kitin dibuat dari larutan koloidal kitin dengan berbagai konsentrasi. Larutan standar pertama dibuat 0,25% b/v koloidal kitin yang dilarutkan dalam bufer fosfat (pH 7) di dalam labu ukur 10 ml. Larutan standar ke dua dibuat dari 0,25% b/v koloidal kitin yang ditambahkan bufer fosfat dengan volume dan pH yang sama. Larutan standar dibuat hingga medapatkan tujuh konsentrasi. Setelah itu, larutan standar diukur dengan spektrofotometer pada λ 660 nm (Kim, 2003).
Satu unit aktivitas adalah jumlah enzim yang menghidrolisis kitin 0,001% (b/v) permenit permili dalam kondisi percobaan. Aktifitas kitinase diukur berdasarkan pengukuran substrat yang dihidrolisis dari substrat awal oleh enzim kitinase. Pengukuran aktivitas menggunakan metode turbidimetri yang menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis. OD (Optical Density) setiap sampel
diukur pada λ 660 nm (Kim, 2003) dan suhu kamar selama 20 menit. OD (Optical
Density) yang diperoleh dikonversi menjadi konsentrasi. Adapun perhitungannya
adalah,
Sisa koloidal kitin = koloidal kitin awal – koloidal kitin terhidrolisis
3.4.9 Karakterisasi enzim kitinase 3.4.9.1 Suhu optimum
Disiapkan 5 buah tabung bersih dan kering. Pada masing-masing tabung dimasukkan kitinase kasar sebanyak 200 μl, dan ditambah dengan 800 μl substrat kitin (0,25% kolodial kitin b/v dalam 50mM bufer fosfat pH 7) dengan volume 4 ml. Masing-masing tabung diinkubasi 20 menit pada suhu yang berbeda-beda, yaitu 30oC, 37oC, 40oC, dan 50oC selama 20 menit. Rentang suhu yang digunakan dalam pengukuran suhu optimum didasarkan pada penelitian dari Yong dkk.(2005), bahwa kitinase stabil pada suhu 25-50oC.
3.4.9.2 pH optimum
Disiapkan 5 buah tabung bersih dan kering. Pada masing-masing tabung dimasukkan kitinase kasar sebanyak 200 μl, dan ditambah dengan 800 μl substrat kitin (0,25% kolodial kitin b/vdalam 50mM bufer fosfat pH 7). Masing-masing tabung diinkubasi 20 menit pada pH yang berbeda-beda, yaitu 4, 5, 6, 7 dan 8 selama 20 menit. Rentang pH yang digunakan dalam pengukuran pH optimum didasarkan pada penelitian dari Yong dkk.(2005), bahwa kitinase stabil pada pH 3-8.
28