3. METODE PENELITIAN
3.3 Prosedur Penelitian
Penelitian produksi XOS dilakukan dalam beberapa tahap yaitu 1) penentuan varietas jagung berdasarkan rendemen xilan tertinggi, 2) ekstraksi xilan dengan pemanasan tongkol jagung (oven dan otoklaf yang
dilakukan dengan satu dan dua siklus, 3) konversi xilan menjadi XOS secara hidrolisis enzimatis (xilanase), 4) pengujian sifat prebiotik dari XOS, 5) pembuatan kukis prebiotik dari XOS tongkol jagung.
Tahap pertama adalah penentuan varietas jagung berdasarkan rendemen xilan tertinggi. Untuk menentukan varietas jagung yang akan digunakan, maka dilakukan pengukuran rendemen xilan tongkol jagung analisis proksimat, dan komposisi serat (serat kasar, selulosa, hemiselulosa dan lignin) dari dua varietas jagung yaitu Bisi dan Pioner. Varietas jagung terpilih yang akan digunakan pada penelitian selanjutnya adalah varietas jagung yang mempunyai rendemen xilan lebih tinggi.
Tahap kedua adalah ekstraksi xilan dari tongkol jagung melalui beberapa metode pemanasan oven dan otoklaf, yang dilakukan dengan satu dan dua siklus pemanasan. Ekstrak xilan yang diperoleh kemudian dianalisis kadar xilan dengan menggunakan KCKT berdasarkan waktu retensi ke- 2.8 menit, total gula, gula pereduksi dan derajat polimerisasi.
Tahap ketiga adalah produksi XOS. Metode yang digunakan adalah konversi xilan yang dihasilkan dihidrolisis secara enzimatis menggunakan xilanase komersial (Novozym) dengan modifikasi metode Richana et al. (2010) sebagai berikut 50 g xilan tongkol jagung kering dalam 250 ml buffer fosfat pH 6, ditambah 1.25 ml xilanase dengan aktivitas xilanase sebesar 24.5 x 106 U/ml, kemudian diinkubasi pada suhu 50 oC selama 6 hari. Setelah inkubasi, sampel dikeringkan pada suhu 60 oC selama 1 jam, dan siap untuk dianalisis kadar XOS nya dengan menggunakan KCKT, detektor refraktif indeks.
Tahap keempat adalah pengujian sifat prebiotik dari XOS tongkol jagung, yang menggunakan dua galur kandidat probiotik yaitu L.plantarum kik dan B. longum ATCC 15707.
Tahap terakhir adalah pembuatan kukis prebiotik dari XOS tongkol jagung sebanyak 5% (basis tepung terigu yang digunakan). Pembuatan kukis prebiotik, bahan-bahan diaplikasikan sesuai dengan formula Gustiar (2009) dengan penambahan XOS sebesar 5% basis tepung terigu (FAO, 1999), kemudian dipanggang pada suhu 134-135 oC, selama 45 menit. Produk kukis XOS prebiotik yang diperoleh diuji tingkat kekerasannya (gf : gram force) menggunakan texture analyzer (Pro CT V1.2 Build 9; Brookfield Engineering Labs; probeTA 39 dengan fixture TA-BT-KI) dibandingkan dengan kukis tanpa XOS. Diagram penelitiannya dapat dilihat padaGambar 10, dibawah ini.
Varietas jagung terpilih Pemilihan Varietas Jagung
(Bisi dan Pioneer) Analisis:
1. Rendemen Xilan 2. Kadar Proksimat
3. Kadar Hemiselulosa, Selulosa dan lignin
Pemanasan
1.Oven (Suhu 130, 140, 150 oC ; 0.5 jam) 2.Otoklaf (Suhu 121 oC ; 0.5, 1, 1.5, 2 jam) Siklus Pemanasan (1-2 kali)
Penambahan air pada tongkol jagung ( rasio tongkol jagung : air = 1:12) Perendaman dalam larutan 1.0 g/l H2SO4
(60 oC, 12 jam) (Delignifikasi) Pencacahan
Pencucian dan ditiriskan
Penambahan aquades dengan Rasio Tongkol Jagung : Aquades = (1:3)
Pendinginan pada suhu ruang
T ah ap pe rt am a T ah ap ke d ua
Xilan kering (db)
Analisis xilan dan XOS dengan KCKT Filtrasi dengan vacuum gauze
Filtrat
Pemilihan proses ekstraksi optimum Analisis:
1.Total gula, 2.Gula pereduksi 3.Derajat polimerisasi
Proses ekstraksi optimum :
1.Oven (130 oC, 0.5 jam, siklus pemanasan sekali) 2.Otoklaf (121 oC, 0.5 jam, siklus pemanasan sekali)
Penyaringan
Hidrolisis enzimatik dengan xilanase, (inkubasi 50 oC, 6 hari) Penghancuran (2500 rpm, 20 menit)
Penambahan buffer fosfat pH 6.0
Inaktivasi enzim melalui pemanasan sampai mendidih
Penyaringan
Padatan
XOS
Analisis XOS dengan KCKT Pengeringan oven suhu 60 oC, 24 jam
Filtrasi dengan vacuum gauze
T ah ap ke ti g a T ah ap ke d ua (L anj ut an)
Gambar 7. Diagram alir penelitian (modifikasi Yang et al., 2005) Ekstrak xilan tongkol jagung
(Ekstrak hereinafter)
Pengeringan oven suhu 60 oC, 24 jam Bubur tongkol jagung
Padatan Bubur tongkol jagung
3.3.1 Seleksi Varietas Jagung
Untuk menentukan varietas jagung yang akan digunakan, maka dilakukan pengukuran rendemen xilan tongkol jagung, analisis proksimat, dan komposisi serat (hemiselulosa, selulosa, dan lignin) dari dua varietas jagung yaitu Bisi dan Pioner. Varietas jagung terpilih yang akan digunakan pada penelitian selanjutnya adalah varietas jagung yang mempunyai rendemen xilan lebih tinggi.
3.3.2 Ekstraksi Xilan dengan Pemanasan Tongkol Jagung dalam Oven dan Otoklaf
Ekstraksi xilan dilakukan dengan dua metode pemanasan yaitu pemanasan oven (partikel tongkol jagung dalam kondisi terendam air) dan pemanasan otoklaf, kemudian kedua metode pemanasan dilanjutkan dengan hidrolisis enzimatik.
Partikel tongkol jagung sebelumnya diberi perlakuan asam encer (1.0 g/l H2SO4) kemudian diblender sampai halus, didiamkan pada suhu 60 oC selama 12 jam (modifikasi metode Yang et al., 2005). Partikel tongkol jagung selanjutnya ditiriskan dan dicuci dengan air kran (pH 6), selanjutnya direndam kembali dalam aquades (rasio 1:3) untuk dipanaskan dalam oven pada beberapa variasi suhu (130 oC, 140 o
C dan 150 oC) dengan masing-masing waktu pemanasan selama 0.5 jam dengan siklus pemanasan satu dan dua kali. Yang dimaksud dengan siklus pemanasan dua kali adalah proses pemanasan diulang setelah tongkol jagung dikeluarkan dari oven setelah pemanasan satu siklus, kemudian tongkol jagung didinginkan, ditambahkan air kembali sampai mencapai seperti volume awal (1:3) dan pemanasan diulang kembali dalam oven. Setelah pemanasan partikel tongkol jagung dalam oven selesai, sampel didinginkan dalam suhu ruang. Ekstrak xilan yang diperoleh dari metode ekstraksi optimum dihancurkan dengan penambahan aquades (1:12) dalam blender (2500 rpm, 20 menit) hingga menjadi bubur. Bubur dari tongkol jagung yang diperoleh, kemudian disaring dengan saringan (yang biasa digunakan untuk tepung). Bubur ini digunakan untuk hidrolisis enzimatik dan
analisis kimia (total gula, gula pereduksi dan derajat polimerisasi). Bubur difiltrasi menggunakan vacuum gauze untuk analisis kimia. Filtrat dianalisis total gula, gula pereduksi dan derajat polimerisasi untuk menetapkan metode ekstraksi xilan dalam oven yang optimum.
Pada metode pemanasan otoklaf, partikel tongkol jagung mentah yang telah direndam dalam asam encer (1.0 g /l H2SO4), diblender sampai halus. Diamkan pada suhu 60ºC selama 12 jam, disaring dan dicuci dengan air kran (pH 6). Tongkol jagung yang telah diberi perlakuan ini diletakkan dalam wadah gelas piala kemudian dimasukkan ke dalam otoklaf. Perhitungan waktu proses (0.5, 1, 1.5 dan 2 jam) dimulai ketika suhu internal dari otoklaf mencapai suhu yang ditetapkan (121 oC) dengan siklus pemanasan 1 dan 2 kali. Setelah pendinginan, otoklaf dibuka dan tongkol yang telah dikukus dikumpulkan. Selanjutnya ekstrak xilan yang diperoleh dari metode ekstraksi optimum dihancurkan dengan penambahan air (1:12) dalam blender (2500 rpm, 20 menit) hingga menjadi bubur. Bubur dari tongkol jagung yang diperoleh kemudian disaring. Bubur ini digunakan untuk hidrolisis enzimatik dan analisis kimia (total gula, gula pereduksi dan derajat polimerisasi). Bubur difiltrasi menggunakan vacuum gauze untuk analisis kimia. Filtrat dianalisis total gula, gula pereduksi dan derajat polimerisasi, untuk menetapkan metode ekstraksi xilan yang optimal baik dalam oven maupun otoklaf. Filtrat yang dihasilkan dinamakan sebagai ekstrak hereinafter, karena mengandung gula pereduksi (xilosa dan XOS), total gula terlarut dan furfural (Yang et al., 2005).
3.3.3 Produksi XOS Melalui Konversi Xilan Menggunakan Xilanase Xilan tongkol jagung yang diperoleh dari metode ekstraksi optimum (oven dan otoklaf) kemudian dikonversi secara enzimatik menggunakan xilanase komersial (Novozym) mengacu dari modifikasi metode Richana et al. (2010). Hidrolisis dilakukan dengan cara sebagai berikut: 50 g xilan tongkol jagung kering ditambahkan
larutan buffer fosfat pH 6 hingga kondisi sampel terendam sempurna, lalu ditambah 1.25 ml xilanase dengan aktivitas xilanase 24.5 x 106 U/ml, kemudian diinkubasi pada suhu 50 oC selama 6 hari. Setelah inkubasi, sampel diinaktivasi enzim melalui pemanasan sampai mendidih. Selanjutnya disaring menggunakan kertas Whatman No. 4. Lalu dikeringkan pada suhu 60 oC selama 1 jam, dan siap untuk dianalisis kadar XOS nya atau digunakan lebih lanjut untuk membuat kukis XOS prebiotik.