METODOLOGI PENELITIAN
2.4 Prosedur Penelitian
2.4.1 Pembuatan Larutan Pereaksi 2.4.1.1 Pembuatan Asam klorida 32 %
Asam klorida 37 % (E’Merck) sebanyak 8,6 ml dipipet dan dimasukkan ke dalam botol yang berisi 10 ml akuades (Ditjen POM, 1995).
2.4.1.2 Pembuatan Natrium hidroksida 10 %
Natrium hidroksida sebanyak 10 gram dilarutkan dalam 100 ml akuades (Ditjen POM, 1995).
2.4.1.3 Pembuatan alkohol 70%, 80%, 90%, 96% dan Alkohol Absolut
Alkohol absolut sebanyak masing-masing 70,1 ml; 80,2 ml; 90,2 ml; 96,2 ml 100 ml masing-masing diencerkan dengan akuades sampai 100 ml (Jones, 1950).
2.4.1.4 Pembuatan larutan Eosin 0,5 %
Eosin Y sebanyak 0,5 gram dilarutkan dalam 100 ml alkohol 95 % dan dicampurkan dengan asam asetat glasial sebanyak 0,5 ml (Jones, 1950).
2.4.1.5 Pembuatan larutan hematoxylin Ehrlich
Hematoxylin sebanyak 0,67 gram dilarutkan dalam alkohol absolute sebanyak 33 ml kemudian ditambahkan gliserol sebanyak 33 ml, asam asetat glasial sebanyak 3,3 ml dan akuades sebanyak 33 ml (Jones, 1950).
2.4.1.6 Pembuatan Albumin
Natrium salisilat sebanyak 1 gram dicampur dengan putih telur dan gliserin masing-masing sebanyak 50 ml (Jones, 1950).
2.4.1.7 Pembuatan Larutan Formalin 10%
Formalin pekat (40%) sebanyak 25 ml diencerkan dengan akuades sampai 250 ml (Jones, 1950).
2.4.1.8 Pembuatan Larutan Kalsium Klorida 0,1 M
Kalsium klorida sebanyak 1,47 gram dilarutkan dalam akuades secukupnya dan ditambahkan hingga 100 ml (Ditjen POM, 1995).
2.4.2 Pembuatan Membran Alginat-kitosan
Prosedur pembuatan membran dilakukan berdasarkan penelitian sebelumnya (Santi, 2008). Ditimbang 1 gram kitosan, kemudian ditambahkan 25 ml akuades dan dilarutkan dalam 5 ml asam asetat glasial sambil digerus dalam lumpang sehingga terbentuk campuran homogen, dipindahkan ke dalam erlenmeyer tertutup. Selanjutnya ditimbang 1 gram natrium alginat dan dilarutkan dalam 25 ml akuades dalam erlenmeyer. Kedua larutan dibiarkan selama 24 jam.
Kedua larutan polimer tersebut kemudian dicampur dan ditambahkan 2 ml asam klorida 32 % kemudian didiamkan 5 menit. Selanjutnya ditambahkan natrium hidroksida 10 % (w/v) sampai diperoleh pH 5,2. Gel yang terbentuk diletakkan di cawan porselen dan dicetak diatas plat kaca objek, masing-masing plat kaca berisi 1 gram gel, diratakan dan kemudian dikeringkan pada suhu kamar. Dalam keadaan setengah kering yaitu setelah pengeringan satu malam, plat kaca objek direndam dan dibilas dalam akuades hingga pH netral, kemudian dikeringkan lagi pada suhu kamar. Waktu pengeringan selama ± 72 jam.
2.4.3 Pembuatan Membran Kalsium Alginat-kitosan
Prosedur pembuatan membran dilakukan berdasarkan penelitian sebelumnya (Santi, 2008). Prosedur yang sama seperti pembuatan membran alginat kitosan, dibuat campuran alginat dan kitosan, dan dicetak di atas kaca objek, lalu dikeringkan pada suhu kamar. Setelah pengeringan satu malam, plat kaca berisi gel campuran alginat dengan kitosan dibilas dan direndam dalam akuades hingga pH netral, masing-masing plat kaca kemudian dicelupkan ke dalam 10 ml larutan kalsium klorida 0,1 M selama 10 detik, diangkat dan dikeringkan pada suhu kamar selama ± 72 jam, hingga diperoleh hasil berupa lapisan yang tipis dan transparan.
2.4.4 Percobaan pada Hewan secara in vivo
Digunakan 9 ekor marmut jantan yang dibeli dari toko hewan dengan berat 700 – 900 gram. Sebelum diperlakukan sebagai hewan percobaan, marmut tersebut diadaptasikan terlebih dahulu terhadap lingkungan selama 2 minggu. Selama percobaan masing-masing marmut dipelihara dalam kandang terpisah dan diberi makan secukupnya. Untuk percobaan, masing-masing marmut diberi perlakuan :
Marmut I,II dan III : Kontrol (Tanpa pengobatan)
Marmut IV,V,dan VI : Pengobatan dengan membran alginat-kitosan Marmut VII, VIII, dan IX : Pengobatan dengan membran kalsium
2.4.5 Pengamatan Penyembuhan Luka 2.4.5.1 Pengamatan Makroskopik
Hewan percobaan sebelum dioperasi, dicukur pada sebelah kanan atau kiri kulit perut marmut, lalu diberi tanda pada kulit perut marmut dengan ukuran 1 x 1,5 cm, kemudian dianastesi secara intramuscular menggunakan phenobarbital injeksi 60 mg/kg BB, kemudian dipotong kulit marmut sampai lapisan dermis menggunakan alat – alat yang sudah disterilkan sedemikian rupa, lalu kulit perut marmut yang telah dilukai difoto dengan kamera digital. Dibersihkan luka menggunakan larutan steril infus salin (NaCl 0,9 %), kemudian ditempel dengan masing-masing membran ukuran 2 x 2 cm lalu ditutup dengan perban steril dan diplester. Untuk kontrol, luka tidak diobati, hanya ditutup perban steril. Dilakukan pergantian membran setiap 3, 6, 9, 12 hari dan sewaktu pergantian sediaan luka dibasahi terlebih dahulu dengan larutan infus salin (NaCl 0,9 %) sampai membran dapat terangkat dari luka. Kemudian luka diamati yaitu adanya peradangan, kekeringan luka, adanya nanah setelah 3, 6, 9, 12 hari dan diukur panjang dan lebar luka. Kemudian organ kulit tersebut direndam dalam formalin 10% (Hafni, 2002).
2.4.5.2 Pengamatan Mikroskopik
Organ kulit marmut yang telah diambil terdiri dari tiga ekor dari kelompok kontrol, tiga ekor dari kelompok alginat-kitosan, dan tiga ekor dari kelompok kalsium alginat-kitosan. Setelah dilakukan pengamatan makroskopik, maka organ kulit marmut difiksasi dalam formalin 10% untuk pembuatan preparat jaringan organ kulit. Setelah hari ke-12 organ kulit marmut diambil kembali difiksasi
dalam formalin 10% untuk selanjutnya dilakukan pembuatan preparat jaringan kulit kembali.
2.4.6 Pembuatan Preparat Jaringan Kulit
Organ kulit yang telah diambil difiksasi dalam larutan formalin 10% selama 2 hari, kemudian dicuci dengan larutan alkohol 70% v/v berulang kali atau didiamkan selama 1 hari. Lalu didehidrasi dalam alkohol bertingkat dimulai dengan merendam di dalam alkohol 70% v/v selama 30 menit, selanjutnya dalam alkohol 80% v/v, 90% v/v, 96% v/v, dan alkohol absolut masing-masing selama 24 jam. Kemudian organ kulit dijernihkan dalam xylol murni 2x30 menit. Lalu organ kulit tersebut dimasukkan ke dalam larutan toluol parafin yang telah mencair di dalam oven selama 60 menit. Selanjutnya berturut-turut organ kulit tersebut dimasukkan ke dalam parafin murni I, II, III masing-masing 60 menit. Setelah itu organ kulit dimasukkan ke dalam cetakan yang berisi parafin cair dan dibiarkan mengeras. Blok parafin yang berisi organ kulit tersebut diiris setebal
6μm – 10 μm dengan menggunakan mikrotom kemudian irisan tersebut diletakkan
pada kaca objek yang telah diolesi dengan albumin dan ditetesi akuades, selanjutnya diletakkan pada meja pemanas sampai jaringan melekat pada kaca objek. Lalu jaringan dimasukkan ke dalam larutan xylol selama 15 menit. Setelah itu jaringan dicelupkan berturut-turut ke dalam alkohol absolut, 96%, 90%, 80%, 70%, dan akuades. Kemudian dilakukan pewarnaan terhadap jaringan dengan memasukkannya ke dalam larutan hematoksilin erhlich selama 3-7 detik dan selanjutnya dicuci dengan air mengalir lebih kurang 10 menit. Lalu dicelupkan ke dalam akuades, alkohol 30%, 50% dan 70%. Setelah itu dilakukan lagi pewarnaan dengan memasukkannya ke dalam larutan eosin 0.5% selama 3 menit dan
dilanjutkan dengan pencelupan dalam alkohol 70%, 80%, 90%, 96% dan alkohol absolut, kemudian dikeringkan dengan kertas penghisap, selanjutnya jaringan tersebut ditetesi dengan kanada balsam dan ditutup dengan gelas penutup. Jaringan diamati dibawah mikroskop preparatif dengan perbesaran okuler 10 kali dan perbesaran objektif 10 dan 40 kali (Jones, 1950).
2.4.7 Uji Kekuatan Tarik
Pengujian kekuatan tarik membran dilakukan pada suhu kamar dengan alat universal testing machine type: SC-2DE, dengan berat beban 100 kgf, dan kecepatan tarik mesin (cross-head) 10 mm/menit. Sampel (membran alginat-kitosan dan kalsium alginat-alginat-kitosan) diletakkan pada kedua penjepit (grip) yang posisinya tegak lurus pada alat tarik. Saklar mesin tarik dan saklar pencatat grafik dihidupkan bersama-sama. Kekuatan tarik membran dapat dilihat dari nilai Load dan Stroke yang dimilikinya. Nilai load (kgf) menyatakan kekuatan tarik pada saat putus, sedangkan stroke (mm/menit) menunjukkan kekuatan tegangan pada saat putus. Nilai load dan stroke biasanya berbanding terbalik (Asteria, 2005).
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN