METODOLOGI PENELITIAN
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Pembuatan Supensi Na-CMC 0.5 %
Lima ratus miligram Na-CMC ditimbang, kemudian dilarutkan dalam sebagian akuades hangat, diaduk dan ditambah akuades sambil terus diaduk memakai batang pengaduk. Setelah larut semua sisa akuades ditambahkan sampai didapatkan volume larutan Na-CMC 100 ml dengan memakai labu takar 100 ml.
3.5.2 Aklitimasi Hewan Uji
Hewan uji terlebih dahulu diadaptasikan (aklitimasi) terhadap lingkungan selama 2 minggu. Hewan uji terdiri dari mencit galur BALB/c setiap kelompok terdiri dari 5 hewan uji. Menurut WHO minimal hewan uji untuk satu kelompok uji adalah 5 ekor.
3.5.3 Uji Peningkatan Total Leukosit, Persentase Limfosit dan Monosit
Mencit BALB/c sebanyak 24 ekor dibagi dalam 4 kelompok perlakuan berdasarkan dosis ektrak etanol jinten hitam yang diberikan. Pemberian ekstrak diberikan selama 14 hari berturut secara oral. Setiap hari ke – 7, hari ke 14 dan hari ke 21. Darah diambil melalui pleksus retro orbital mata mencit.
Tabel 3.1. Kelompok untuk uji total leukosit, limfosit dan monosit
No Kelompok Perlakuan Pengambilan
Darah 1. Kontrol diberikan Na-CMC 0.5% 0.5
ml/kgBB selama 14 hari berturut - turut
Hari ke - 7, ke - 14, dan Ke 21 2. Dosis
Rendah
diberikan ekstrak etanol jinten hitam 125 mg/kgBB selama 14 hari berturut – turut
Hari ke - 7, ke - 14, dan Ke 21 3. Dosis
Sedang
diberikan ekstrak etanol jinten hitam 250 mg/kgBB selama 14 hari berturut – turut
Hari ke - 7, ke - 14, dan Ke 21 4. Dosis
Tinggi
diberikan ekstrak etanol jinten hitam 500 mg/kgBB selama 14 hari berturut – turut
Hari ke - 7, ke - 14, dan Ke 21
24
3.5.4 Uji Kadar Interleukin 1β (IL-1β)
Pada uji kadar IL-1β dilakukan pemberian ekstrak etanol jinten hitam secara oral dengan dosis 125 mg/kgBB, 250 mg/kgBB dan 500 mg/kgBB. Selanjutnya pada hari ke – 5, dua jam setelah pemberian ekstrak etanol jinten hitam diberikan LPS 20 μg/mencit. Darah mencit diambil 6 jam kemudian, melalui pleksus retro orbital mata mencit (Manu dan Kuttan, 2008).
Tabel 3.2 Data Perlakuan untuk uji kadar IL - 1β
No Kelompok Perlakuan Pengambilan
darah 1. Kontrol diberikan Na-CMC 0.5% 0.5
ml/kgBB selama 5 hari berturut - turut
Hari ke – 5
2. LPS Diberikan LPS 20 μg/mencit pada
hari ke 5
Hari ke – 5
3. Ekstrak
Etanol Dosis Rendah
diberikan ekstrak etanol jinten hitam 125 mg/kgBB selama 5 hari berturut - turut. Hari ke – 5 dua jam setelah pemberian ekstrak, diberikan LPS 20 μg/mencit
Hari ke – 5
4. Ekstrak
Etanol Dosis Sedang
diberikan ekstrak etanol jinten hitam 250 mg/kgBB selama 5 hari berturut - turut. Hari ke – 5 dua jam setelah pemberian ekstrak, diberikan LPS 20 μg/mencit
Hari ke – 5
5. Ekstrak
Etanol Dosis Tinggi
diberikan ekstrak etanol jinten hitam 500 mg/kgBB selama 5 hari berturut - turut. Hari ke – 5 dua jam setelah pemberian ekstrak, diberikan LPS 20 μg/mencit
Hari ke – 5
3.5.5 Pengambilan darah
Darah diambil dari setiap hewan uji melalui pleksus retro orbital mata mencit. Sampel darah untuk uji total leukosit dimasukkan ke dalam tabung vacutainer EDTA dan sampel darah untuk uji IL-1β dimasukkan ke tabung vacutainer EDTA yang berbeda. Darah untuk uji IL-1β disentrifus pada 3000 rpm selama 20 menit, plasma yang muncul dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf disimpan pada suhu – 20oC sampai waktu
pemeriksaan IL-1β dengan ELISA.
3.5.6 Perhitungan Total Leukosit
Penghitungan jumlah leukosit total dilakukan menggunakan hemositometer dengan pengenceran 1:20. Untuk memperoleh pengenceran 1:20 sampel darah dihomogenkan, kemudian dihisap dengan menggunakan pipet leukosit dan aspirator sampai tera 0,5. Selanjutnya, larutan Turk dihisap hingga tera 11, aspirator dicabut kemudian dihomogenkan secara manual, yaitu dengan cara memutar membentuk angka 8. Selanjutnya sampel dibuang sekitar 2-3 tetes, setelah itu dimasukkan ke dalam kamar hitung Neubauer dan ditutup dengan gelas penutup kemudian diperiksa dengan mikroskop perbesaran 40 x 10. Leukosit dihitung pada empat kotak besar di tiap sudut tiap sisi kamar hitung. Sel yang menempel di garis pemisah sebelah kiri dan di garis atas kotak persegi ikut dihitung, sel yang menempel di kedua sisi kotak lain tidak ikut dihitung (Anandika, 2011).
Karena kedalaman kamar kamar hitung Neubauer adalah 0,1 mm dan luas adalah 4 mm2 (terdiri dari 4 kamar masing-masing dengan luas 1
mm2 jadi total 4 mm2). Maka volume kotak adalah 0,4 mm3(Kulisic, 2006)
Jumlah total leukosit per mm3 = N x faktor pengenceran Volume Kotak = Nx20
0,4 ��3
= 50 N
N : Jumlah total leukosit dari 4 kamar hitung
26
3.5.7 Analisa Persentase Monosit dan Limfosit
Sampel darah segar diteteskan pada gelas objek dan dibuat preparat apus. Setelah dibiarkan mengering di udara, preparat apus kemudian difiksasi dengan methanol selam 5 menit. Preparat kemudian diwarnai dengan pewarna Giemsa dengan pengenceran 1 : 9 selama 30 menit.. Selanjutnya preparat dicuci menggunaan aquades dan dibiarkan mengering. Setelah kering preparat diperiksa dibawah mikroskop dengan pembesaran 100 x dengan dibubuhi minyak emersi pada permukaan sediaan apus tersebut. Pertama – tama dihitung sampai 100 sel leukosit, kemudian dari 100 sel leukosit dihitung jumlah monosit dan limfosit. Lalu ditentukan persentase monosit dan limfosit dari total 100 leukosit tersebut dengan rumus sebagai berikut (Handajani dan Dharmawan , 2009).
% Limfosit = ∑ ��������100 � 100 % % Monosit = ∑ �������
100 � 100 %
Gambar 4.1 Skema pembacaan diferensiasi leukosit
3.5.8 Pengukuran kadar IL-1β dengan ELISA
Sebanyak 0.1 ml sampel, kontrol dan standar dimasukkan ke dalam
microplate yang telah dilapisi anti - mouse IL - 1β antibodi kemudian diinkubasi selama 90 menit pada suhu 370C lalu membuang isi plate dan
keringkan menunggunakan handuk, Tambahkan 0.1 ml biotinylated anti mouse IL - 1β antibody inkubasi pada suhu 370C selama 60 menit lalu
mencuci microplate dengan 0.01M PBS sebanyak 3 kali. Tambahkan 0,1ml larutan ABC diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit lalu
mencuci microplate dengan 0.01M PBS sebanyak 5 kali.
Menambahkan 90 ul dengan TMB Color developing agen dan didiamkan selama 30 menit pada suhu ruangan di tempat yang gelap. Ditambahkan 0.1 ml TMB stop solution. Dibaca optical density absorbasi dengan ELISA reader yang diatur pada 450 nm.
3.5.9 Analisa Statistik
Analisa jumlah total leukosit, presentase monosit, presentase limfosit dan kadar IL-1β menggunakan ANOVA (Analysis Of Variance) dengan menggunakan program SPSS 17,0 for windows taraf kepercayaan
sebesar 95% dengan (α= 0,05).
BAB 4