Prosedur Penelitian

METODOLOGI PENELITIAN

3.2 Prosedur Penelitian

3.2.1 Pembuatan Larutan Pereaksi

3.2.1.1 Pembuatan Larutan Buffer Asetat 0,2 M

Dipipet sebanyak 11,55 ml asam asetat p.a lalu diencerkan dalam labu takar 100 ml sehingga konsentrasi larutan asam asetat 0,2 M. Kemudian ditimbang natrium asetat sebanyak 16,4 gram C2^H3^O2^Na.3H2^{O dilarutkan dalam labu takar 100 ml sehingga}

konentrasi larutan garam natrium asetat 0,2 M. Kemudian untuk membuat larutan buffer asetat dengan pH tertentu maka diambil sebanyak x ml larutan 0,2 M asam

asetat dicampurkan dengan larutan 0,2 M larutan garam natrium asetat sebanyak y ml. Lihat tabel di bawah ini:

Tabel 3.1. Pembuatan Larutan Buffer Asetat 0,2 M

pH 0,2 M Asam Asetat 0,2 M Natium Asetat

3,5 46,3 ml 3,7 ml

4,0 41,0 ml 9,0 ml

4,5 25,5 ml 24,5 ml

5,5 14,8 ml 35,2 ml

5,5 4,8 ml 45,2 ml

3.2.1.2.Pembuatan Larutan NaOH 0,1 N

Dilarutkan 0,4 g NaOH dengan akuades kemudian dimasukkan kedalam labu takar 100 ml dan diencerkan sampai garis tanda.

3.2.1. 3 Pembuatan Larutan NaCl 1%

Dimasukkan 1 g NaCl dalam labu takar 100 ml kemudian diencerkan dengan akuades sampai garis tanda.

3.2.1.4 Pembuatan Larutan Glukosa 0,2mg/ml

Sebanyak 20 mg glukosa anhidrat dilarutkan dengan akuades dalam labu takar 100 ml sampai garis tanda dan dikocok sampai homogen.

3.2.1.5 Pembuatan Larutan pereaksi Nelson

Nelson A :

Dilarutkan12,5 g Natrium karbonat anhidrat, 12,5 g garam Rochelle (K-Na-Tartrat), 10 g Natrium Bikarbonat dan 100 g Natrium Sulfat anhidrat dalam 300 ml akuades dan diencerkan sampai 500 ml.

Nelson B :

Dilarutkan 7,5 g CuSO_4.5H₂O dalam 50 ml akuades dan ditambahkan 1 tetes asam sulfat pekat.

Pereaksi Nelson dibuat dengan cara mencampur 25 bagian larutan Nelson A dan I bagian Nelson B. Pencampuran dilakukan setiap kali akan digunakan.

3.2.1.6 Pembuatan Larutan Arsenomolibdat

Dilarutkan 25 g ammonium molibdat dalam 450 ml aquades dan ditambahkan 25 ml H2^SO4^{(p) .Dilarutkan pada tempat yang lain 3 g Na}2^HAsO4.^7H2^{O dalam 25 ml}

akuades kemudian dituangkan larutan ini kedalam larutan yang pertama.Disimpan dalam botol, berwarna coklat dan diinkubasi pada suhu 37^oC selama 24 jam. Larutan pereaksi ini dapat digunakan setelah masa inkubasi dan berwarna kuning.

3.2.2 Penyediaan Ekstrak Kasar Enzim Selulase

Ditimbang 250 g saluran pencenaan bekicot,ditambahkan 500 ml larutan NaCl 1% (dingin) dan diblender selama ± 30 detik kemudian di sentrifugasi pada 7000 rpm selama 30 menit. Supernatan yang terbentuk sebanyak 400 ml kemudian ditambahkan aseton dingin sebanyak 200 ml hingga terjadi suatu suspensi. Kemudian suspensi ini disentrifugasi pada 7000 rpm selama 30 menit. Pellet yang diperoleh di keringkan dalam freeze drier pada suhu -40^oC sampai pellet dalam keadaan kering. Kemudian ekstrak serbuk yang didapat diambil sebanyak 0,5 gram dan dilarutkan dalam 50 ml buffer asetat 0,1 M pH 4,5. Kemudian ekstrak kasar enzim selulase disimpan di lemari es dan siap untuk di analisis.

3.2.3 Pengukuran Panjang Gelombang Maksimum Larutan Standar Glukosa

Ditimbang 20 mg glukosa dan dilarutkan dengan akuades sampai volume 100 mL (Larutan glukosa 0,2 mg/mL). Dipipet 25 ml larutan lalu diencerkan dengan akuades sampai volume 100 mL (larutan glukosa 0,05 mg/mL).Dipipet 1 mL larutan glukosa 0,05 mg/mL kedalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 1 mL pereaksi Nelson lalu ditutup dengan kapas dan dipanaskan pada penangas air sampai mendidih selama 30

menit lalu didinginkan. Lalu ditambahkan 0,5 mL Larutan arsenomolibdat lalu dikocok hingga semua endapan larut. Ditambahkan 7 mL akuades dikocok hinga homogen. Diukur serapan panjang gelombang pada 400 – 800 nm. (diperoleh panjang gelombang maksimum).

3.2.4 Penyiapan Kurva Standar Glukosa

Disiapkan larutan glukosa standar dalam beberapa tabung reaksi dengan konsentrasi bertingkat dari 0,01 – 0,05 mg/mL. Ditambahkan 1 mL Larutan Nelson kemudian dipanaskan hingga mendidih selama 30 menit dan didinginkan.Ditambahkan 0,5 mL Larutan arsenomolibdat lalu dikocok. Kemudian ditambahkan 7 mL akuades lalu dikocok hingga homogen. Diukur serapannya pada panjang gelombang 761 nm. Dibuat kurva standar yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi gula standar dan absorbansi.

3.2.5. Penentuan Suhu Optimum Ekstrak Kasar Enzim Selulase

Ditimbang 0,05 mg selulosa dan dimasukkan masing – masing ke dalam 5 gelas beaker dan ditambahkan 5 ml buffer asetat pH 4,5 ( 6 ml untuk blanko). Ditambahkan 1 ml ekstrak kasar enzim selulase (blanko tanpa enzim) lalu ditambahkan 1 ml NaCl 1%. Kemudian diinkubasi dengan variasi suhu 35^oC; 40^oC; 45^oC; 50^oC dan 55^oC selama 1 jam. Setelah itu ditambahkan 1 ml NaOH 0,1 N lalu disentrifugasi pada 3400 rpm selama 20 menit. Diambil 1 ml supernatan lalu diencerkan dalam labu takar 10 ml kemudian dihomogenkan. Dimasukkan 1 ml hasil pengenceran kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 1 ml pereaksi Nelson dan dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Kemudian diangkat dan didinginkan sampai suhunya mencapai 25^oC. Diambahkan 0,5 ml arsenomolibdat lalu dikocok sampai semua endapan larut .Kemudian ditambahkan 7 ml akuades lalu dikocok hingga homogen. Diukur serapannya pada panjang gelombang 761 nm. Dilakukan perlakuan yang sama untuk substrat kertas dan ampas tebu.

3.2.6. Penentuan pH Optimum Ekstrak Kasar Enzim Selulase

Ditimbang 0,05 mg selulosa dan dimasukkan masing – masing kedalam 5 gelas beaker dan ditambahkan 5 ml buffer asetat pH 3,5; 4,0; 4,5; 5; 5,5 (6 ml untuk blanko). Ditambahkan 1 ml ekstrak kasar enzim selulase (blanko tanpa enzim) lalu ditambahkan 1 ml NaCl 1%. Kemudian diinkubasi pada suhu 45^oC selama 1 jam. Setelah itu ditambahkan 1 ml NaOH 0,1 N lalu disentrifugasi pada 3400 rpm selama 20 menit.. Diambil 1 ml supernatan lalu diencerkan dalam labu takar 10 ml kemudian dihomogenkan. Dimasukkan 1 ml hasil pengenceran kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 1 ml pereaksi Nelson dan dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Kemudian diangkat dan didinginkan sampai suhunya mencapai 25^oC. Diambahkan 0,5 ml arsenomolibdat lalu dikocok sampai semua endapan larut. Kemudian ditambahkan 7 ml akuades lalu dikocok hingga homogen. Diukur serapannya pada panjang gelombang 761 nm. Dilakukan perlakuan yang sama untuk substrat kertas dan ampas tebu.

3.2.7 Pengukuran Aktivitas Ekstrak Kasar Enzim Selulase

Dimasukkan 0,05 mg selulosa (blanko tanpa substrat) kedalam tabung reaksi lalu ditambahkan 5 ml buffer asetat pH 4,5. Ditambahkan 1 ml ekstrak kasar enzim selulase lalu ditambahkan 1 ml NaCl 1%. Kemudian diinkubasi pada suhu 45^o C selama 1 jam. Setelah itu ditambahkan 1 ml NaOH 0,1 N lalu disentrifugasi pada 3400 rpm selama 20 menit.. Diambil 1 ml supernatan lalu diencerkan dalam labu takar 10 ml kemudian dihomogenkan. Dimasukkan 1 ml hasil pengenceran kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 1 ml pereaksi Nelson dan dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Kemudian diangkat dan didinginkan sampai suhunya mencapai 25^oC. Diambahkan 0,5 ml arsenomolibdat lalu dikocok sampai semua endapan larut .Kemudian ditambahkan 7 ml akuades lalu dikocok hingga homogen. Diukur serapannya pada panjang gelombang 761 nm. Dilakukan perlakuan yang sama untuk substrat kertas dan ampas tebu.