METODOLOGI PENELITIAN
3.3. Prosedur Penelitian
1. Buah Mahkota Dewa (P. macrocarpa Boerl.)
2. Etil Asetat Teknis
3. Kloroform p.a Merck
4. Metanol Destilasi 5. HCl 6% 6. n-heksana Teknis 7. FeCl 5% 8. NaOH 10% 9. Mg-HCl 10.H2SO4(p) 11.Aquades
12.Silika Gel 40 (70-230 Mesh) ASTM E.Merck.KgaA
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan sampel
Sampel yang diteliti adalah buah mahkota dewa yang diperoleh dari Perumnas Simalingkar Medan, Sumatera Utara. Buah mahkota dewa dihaluskan dengan cara dipotong kecil-kecil kemudian dikeringkan di udara terbuka hingga diperoleh potongan daging buah mahkota dewa kering sebanyak 1170 g.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daging Buah Mahkota Dewa
Serbuk kering buah mahkota dewa diidentifikasi dengan menggunakan cara: 1. Uji Busa
2. Skrining Fitokimia
3.3.2.1Uji Busa
Ekstrak metanol daging buah mahkota dewa sebanyak 5 ml dimasukkan kedalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 10 ml Aquades, lalu dikocok-kocok dengan kuat hingga terbentuk busa dan didiamkan selama 5 menit. Melalui perlakuan tersebut dalam sampel terdapat senyawa glikosida.
3.3.2.2Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa Flavonoida yang terdapat dalam buah mahkota dewa (P. macrocarpa Boerl.) maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut :
Prosedur :
- Dimasukkan 10 gram serbuk kering daging buah mahkota dewa (P. macrocarpa Boerl.)
- Ditambahkan 100 ml metanol - Didiamkan selama 1 malam - Disaring
- Dibagi ekstrak metanol kedalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi
a) Tabung I : dengan FeCl3 1% menghasilkan larutan berwarna hitam
b) Tabung II : dengan H2SO4(p) menghasilkan larutan berwarna orange kekuningan
c) Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda d) Tabung IV : dengan NaOH 10% menghasilkan larutan berwarna Biru
3.3.2.3Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap Ekstrak Kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60F254. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yg digunakan adalah campuran pelarut n-heksana: etil asetat (90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40) v/v, sehingga diperoleh perbandingan pelarut n-heksana: etil asetat yang sesuai untuk kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan berdasarkan pada jumlah bercak atau noda yang terpisah dengan baik dalam kromatografi lapis tipis.
Prosedur Analisis Kromatografi Lapis Tipis :
Kedalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan larutan fase gerak yaitu campuran n-heksana: etil asetat dengan campuran ( 90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 ) v/v. Kemudian ekstrak kloroform di totolkan pada plat KLT. Lalu plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi pelarut yang dijenuhkan. Setelah dielusi, dikeluarkan dari bejana dan dikeringkan. Noda terbentuk diamati dengan sinar Ultra Violet dan difiksasi dengan pereaksi FeCl3 1%. Kemudian dihitung dan dicatat harga Rf. Yang memberikan pemisahan bercak noda yang baik adalah perbandingan perlarut n-heksana: etil asetat ( 70:30) v/v yang memberikan 3 noda dengan harga Rf yaitu 0,55 ; 0,42 dan 0,33.
3.3.3 Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Dari Ekstrak Buah Mahkota Dewa
Serbuk dari daging buah mahkota dewa ditimbang sebanyak 1170 g, dimasukkan kedalam ekstraktor kemudian ditambahkan dengan pelarut metanol sampai semua sampel terendam oleh pelarut dan dibiarkan selama ± 72 jam dan sesekali diaduk. Ekstrak disaring dan diperoleh ekstrak berwarna merah kecoklatan. Maserasi dilakukan secara berulang kali dengan menggunakan pelarut metanol hingga ekstrak metanol yang diperoleh memberikan hasil uji yang negatif pada pereaksi untuk identifikasi senyawa Flavonoida. Ekstrak metanol yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan alat rotari-evaporator pada suhu 60oC sehingga diperoleh ekstrak pekat
metanol, kemudian di ekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksana, sehingga terbentuk 2 lapisan n-heksana dan lapisan metanol. Kemudian fraksi metanol ditampung dan dipekatkan dan kemudian dihidrolisa dengan menggunakan HCl 6%. Kemudian disaring dan fitrat yang diperoleh diekstraksi partisi dengan kloroform secara berulang-ulang. Ekstrak kloroform dipekatkan kembali dengan menggunakan alat rotari-evaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 14,62 g.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida Dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat klorofom dari buah mahkota dewa yang diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dan fase gerak yaitu n-heksana 100% dan campuran pelarut n-heksana : etil asetat (90:10 ; 80:20 ; 70:30 ) v/v.
Prosedur Isolasi Senyawa Flavonoida Dengan Kromatografi Kolom :
Dirangkai alat kolom kromatografi, dimana terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 (70-230 mesh) ASTM dengan menggunakan n-heksana. Diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Kemudian di elusi dengan menggunakan n-heksana 100% hingga silika gel dalam kolom padat dan homogen. Dimasukkan 14,62g ekstrak klorofom buah mahkota dewa kedalam kolom kromatografi yang telah diisi dengan bubur silika gel yang telah dielusi. Kemudian ditambahkan fasa gerak n-heksana: etil asetat dengan perbandingan mulai dari (90:10)v/v; (80:20)v/v; (70:30)v/v, secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa gerak yang keluar dari Kolom Kromatografi sama banyaknya dengan jumlah fasa gerak yang ditambahkan. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 8 ml. Kemudian di KLT dan digabung fraksi yang berharga Rf sama. Setelah itu dilakukan uji Flavonoida dan diuapkan pelarutnya.
3.3.5 Pemurnian
Prosedur
Senyawa hasil isolasi di rekristalisasi, dengan cara melarutkan kembali dengan Aseton dan kemudian diuapkan di udara terbuka hingga diperoleh kristal murni sebanyak 80mg.
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak n-heksana: etil asetat dengan perbadingan (70:30) v/v.
Prosedur uji kemurnian hasil isolasi dengan kromatografi lapis tipis.
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak n-heksana: etil asetat kedalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya telah dilarutkan dengan klorofom pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT yang telah ditotolkan tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes hingga batas atas plat KLT dikeluarkan dari bejana kemudian dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan FeCl3 5% menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida. Perlakuan yang sama dilakukan dan difiksasi dengan NaOH 10% yang menghasilkan bercak berwarna biru violet.
3.3.7 Analisis Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1 Pengukuran Titik Lebur Senyawa hasil Isolasi
Senyawa hasil isolasi memiliki rentangan titik lebur 172 – 174oC
3.3.7.2Analisis senyawa hasil isolasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analasis spektrofotometer UV-Visible dilakukan di Pusat Penelitian LIPI, Serpong - Tangerang.
3.3.7.3 Analisis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Infra Merah Analasis spektrofotometer FT-IR dilakukan di Pusat Penelitian LIPI, Serpong - Tangerang.
3.3.7.4 Analsis Senyawa Hasil Isolasi Dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Analasis dengan spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) dilakukan di Pusat Penelitian LIPI, Serpong Tangerang. Dengan menggunakan Aseton sebagai pelarut.