METODOLOGI PENELITIAN
D. Prosedur Penelitian
commit to user
a. Determinasi dan Preparasi Sampel
Umbi lobak dideterminasi di Fakultas Farmasi, Universitas Setia Budi, Surakarta. Umbi lobak dicuci, dikupas kulitnya, dipotong tipis-tipis kemudian dikeringkan dengan oven pada suhu 45oC selama 2 hari selanjutnya umbi lobak kering diblender sampai berbentuk serbuk.
b. Ekstraksi sampel umbi lobak
Sebanyah 30 gram serbuk kering umbi lobak diekstraksi dengan alat soxhlet dengan pelarut petroleum eter sebanyak 300 ml selama 3 jam. Selanjutnya ekstrak yang terkumpul dievaporasi sampai kering dan diperoleh ekstrak PE pekat
c. Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Petroleum eter
Ekstrak petroleum eter dibuat konsentrasi tertentu dengan pelarut dimetil sulfoksida (DMSO). Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi lubang dengan tahap kerja sebagai berikut:
a. Sterilisasi Alat yang Digunakan untuk Pengujian Antibakteri
Semua alat seperti cawan petri, pelubang, spatula logam, jarum ose, tempat sampel dan peralatan gelas yang lainnya yang digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121ºC selama 20 menit.
b. Pembuatan media agar miring
Sebanyak 20 gram NA (Nutrien Agar) dilarutkan dalam 1 L akuades, kemudian dipanaskan dengan stirer sampai warna kuning bening. Larutan NA kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing – masing sebanyak 5 ml.
Tabung reaksi ditutup dengan kapas dan alumunium foil lalu disterilisasi pada suhu 121ºC selama 20 menit. Tabung reaksi ditempatkan ditempat yang miring dan didiamkan sampai padat pada suhu kamar.
c. Pembuatan biakan bakteri
Bakteri uji ditempelkan pada media miring agar NA dengan pola zig zag, masing – masing bakteri dibuat 3 biakan bakteri dan dilakukan dalam keadaan steril pada ruang isolasi dengan sinar UV. Kemudian biakan diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 1 hari untuk semua bakteri uji.
commit to user d. Penyediaan suspensi bakteri uji
Untuk membuat suspensi bakteri, ambil 1 ose bakteri kemudian dimasukkan ke dalam 3 ml dalam aquades steril, dengan catatan 1 tabung untuk 1 bakteri. Larutan diaduk sampai keruh, lalu ditutup dengan kapas.
e. Uji antibakteri
Sebanyak 1 gram NA dilarutkan dalam aquades 50 ml dan dipanaskan sampai kuning bening. Larutan NA kemudian dimasukkan ke dalam botol duran masing – masing sebanyak 15 ml. 100 µl suspensi bakteri diambil lalu taruh dalam cawan petri yang steril. Ke dalam cawan petri yang berisi suspensi bakteri, kemudian dituangkan media NA steril sebanyak 15 ml dalam suhu tubuh sekitar 30 - 37ºC (tidak terlalu panas dan tidak terlalu dingin), cawan petri digoyangkan sehingga kedua larutan tercampur rata. Campuran tersebut didiamkan sampai beku ( ±15 menit). Setelah itu, dibuat lubang dengan ukuran 6 mm dengan alat pervorator dan spatula. Lubang tersebut diisi dengan 20 µl sampel yang telah dicampur dengan DMSO. Cawan petri dibungkus kembali dengan kertas dan diinkubasi selama 1 hari pada suhu 37ºC.
d. Pemisahan Ekstrak Petroleum eter
Ekstrak petroleum eter kental dilakukan pemisahan dengan menggunakan Kromatografi Vakum Cair (KVC). Sebelum melakukan pemisahan dilakukan persiapan kolom KVC dan persiapan sampel. Silika gel 60 GF sebanyak 25 gram dimasukkan kedalam kolom kromatografi sampai padat dengan cara ditekan-tekan sambil di buchner. Sampel sebanyak 5 gram dilarutkan dalam 15 ml petroleum eter kemudian dicampur dengan silika gel F254 sampai tercampur rata. Setelah homogen, sampel dibiarkan beberapa saat sampai kering.
Sampel ekstrak petroleum eter kering kemudian dimasukkan kedalam kolom kromatografi yang telah diisi dengan silika gel 60 GF, sebelumnya dimasukkan kertas saring didalam kolom untuk menahan sampel agar tidak berterbangan. Eluen utuk penggrojogan pertama adalah heksana yang dilanjutkan dengan etil asetat, untuk mendapatkan fraksi heksana dan fraksi etil asetat.
commit to user
Fraksi heksana dan etil asetat yang diperoleh kemudian diuapkan plearutnya dengan penguap vakum putar dengan suhu 40°C hingga diperoleh fraksi heksana kental dan fraksi etil asetat kental.
e. Pengujian Antibakteri terhadap Fraksi-Fraksi Hasil KVC a. Uji aktivitas fraksi-fraksi hasil KVC
Fraksi-fraksi yang didapat dilakukan pengujian antibakteri menggunakan tahapan kerja seperti pada pengujian pada ekstrak petroleum eter untuk mendapatkan fraksi teraktif antibakteri.
b. Penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri
Penetapan KHM dilakukan untuk mengetahui konsentrasi terendah sampel uji yang masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri. Penetapan KHM dilakukan dengan metode perforasi sama seperti pengujian antibakteri, dengan melakukan variasi konsentrasi sampel. KHM dilakukan terhadap fraksi hasil KVC yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi.
c. Penetapan KHM amoksisilin
Konsentrasi Hambat Minimum amoksisilin murni ditetapkan dengan cara yang sama dengan penetapan KHM fraksi teraktif antibakteri. Variasi konsentrasi amoksisilin dibuat dengan melarutkannya dalam buffer phosfat PH
f. Pengujian Golongan Senyawa yang Bersifat Antibakteri
Pengujian kualitatif golongan senyawa dilakukan terhadap ekstrak petroleum eter dan fraksi hasil KVC yang paling aktif antibakteri. Hal ini bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa yang terisolasi dan bersifat antibakteri pengujian ini dilakukan dengan penapisan fitokimia dan uji penegasan dengan KLT. Penapisan fitokimia dilakukan terhadap golongan senyawa flavonoid, fenolat, saponin, alkaloid, asam lemak, terpenoid, steroid, dan karotenoid. Uji penegasan dilakukan terhadap ekstrak yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dengan KLT. Metode penapisan fitokimia yang digunakan berdasarkan Pedrosa et al. (1978); Farnsworth (1966); dan Harborne (1996).
a. Pembuatan reagen
1. FeCl31% : FeCl3 sebanyak 1 g dilarutkan dalam 100 ml aquades.
commit to user
2. Larutan gelatin : Gelatin sebanyak 1 g dilarutkan ke dalam 100 ml aquades panas sambil diaduk.
3. NaCl 10% : NaCl sebanyak 10 g dilarutkan ke dalam 100 ml aquades.
4. AlCl3 1% : AlCl3 sebanyak 0,1 g dilarutkan ke dalam 10 ml etanol 95%.
5. Penyemprot Vanillin–H2SO4 : (i) 5% H2SO4 dalam etanol, (ii) 1% vanilin dalam etanol dan plat disemprot larutan (i) kemudian larutan (ii).
6. Pereaksi Wagner : KI sebanyak 2 g dan iodine sebanyak 1,27 g dilarutkan ke dalam aquades sampai volumenya 100 ml, kemudian disimpan dalam botol gelap.
7. SbCl3 20%dalam kloroform : 2g serbuk SbCl3 dilarutkan dalam 10 mL kloroform.
b. Pengujian golongan senyawa 1. Lemak dan Asam Lemak
5 ml ekstrak petroleum eter diuapkan sampai kering kemudian ditambah 5 ml larutan KOH 0,5 N dalam etanol, kemudian direfluks sehingga tidak terlihat tetesan minyak pada permukaan cairan, etanol dihilangkan dengan cara dipanaskan dalam suhu 80 oC. Sisa dilarutkan dalam air panas dan diekstraksi dengan eter 2x10 ml. fraksi eter digunakan untuk identifikasi steroid, terpenoid, dan karotenoid. Fraksi air diasamkan dengan HCL dan diekstraksi lagi dengan eter. Ekstrak eter diuapkan jika sisa berminyak maka ekstraksi eter tersebut mengandung asam lemak.
2. Steroid dan Terpenoid
Lebih kurang 5ml ekstrak eter diuapkan hingga kering dan dilarutkan dalam 0,5 ml anhidrit asam asetat. Ditambahkan 0,5 ml kloroform kemudian diuapkan kedalam larutan ditambahkan 2-3 tetes H2SO4 pekat (reaksi Lieberman- Burchard). Perubahan warna yang terbentuk cincin merah kecoklatan (ungu)
3. Karotenoid
commit to user
Lebih kurang 5 ml ekstrak eter diuapkan hingga kering kemudian ditambah 2-3 tetes jenuh SbCl3 dalam kloroform. Karotenoid akan menghasilkan warna merah.
4. Alkaloid
Ekstrak diambil sebanyak 20 mg, ditambah dengan HCl 2M, dipanaskan diatas penangas air sambil diaduk, kemudian didinginkan hingga suhu ruang.
NaCl serbuk ditambahkan, diaduk dan disaring, kemudian filtrat ditambah HCl 2M hingga volume tertentu. Filtrat dibagi dalam 2 tabung reaksi, tabung 1 ditambah reagen Wagner dan tabung 2 sebagai blangko. Tabung 1 diamati terbentuknya endapan dan dibandingkan dengan larutan blangko pada tabung 2.
Jika tidak terbentuk endapan, bahan tidak mengandung alkaloid dan jika terbentuk endapan pada bahan terbentuk alkaloid.
5. Saponin
Ekstrak diambil sebanyak 15mg dan dimasukkan dalam tabung reaksi.
Ekstrak ditambah akuades dengan perbandingan 1 g ekstrak : 1mL akuades, kemudian dikocok dan didiamkan. Jika terbentuk buih yang tidak menghilang selama 30 menit maka ekstrak mengandung saponin.
6. Flavonoid
Ekstrak sebanyak 20mg dilarutkan dalam etanol 96% dibagi menjadi 2 tabung. Tabung 1 sebagai blangko. Tabung 2 ditambah dengan 2 tetes HCl pekat, diamati warna yang terjadi dan dibandingkan dengan larutan blangko. Larutan dihangatkan diatas penangas air selama 15 menit, kemudian diamati perubahan warna yang terjadi. Terbentuknya warna merah kuat atau violet menunjukan adanya senyawa leucosantin.
7. Fenolat
Ekstrak sebanyak 10 mg ditambah dengan larutan besi (III) klorida 1%
dalam air. Fenolat positif jika terjadi perubahan warna hijau, merah ungu, biru/hitam.
Uji penegasan skrining fitokimia dengan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) hanya dilakukan terhadap golongan senyawa yang memberikan hasil
commit to user
positif pada uji tabung. Sistem KLT untuk masing-masing golongan senyawa dalam ekstrak petroleum eter yaitu sebagai berikut:
1. Uji Flavonoid
Ekstrak sampel ditotolkan pada lempeng plat Silika Gel F254. Elusi dilakukan dengan fase gerak etil asetat : asam formiat : asam asetat : air (100 : 11 : 11 : 27) dalam 2 ml. Plat dikeringkan dan disemprot dengan pereaksi ALCl3 1%.
Kemudian plat diamati. Flavonoid akan memberikan warna kuning pada cahaya tampak dan kuning, hijau pada UV 254 nm..
2. Uji Senyawa Fenolat
Uji senyawa fenolat menggunakan penyemprot FeCl3 1% dan elusi dilakukan dengan fase gerak etil asetat : metanol : air (100 : 13,5 : 10) dalam 2 ml.
Kemudian plat diamati pada cahaya tampak dan UV 254 nm. Fenolat akan memberikan warna hijau atau biru kehitaman jika diamati pada cahaya tampak.
3. Uji Saponin
Uji KLT untuk saponin dilakukan dengan fase gerak heksana : etil asetat (8,5 : 1,5 ml) dalam 2 ml. Plat dikeringkan kemudian disemprot dengan pereaksi SbCl3 20%. Plat kemudian diamati pada cahaya tampak dan UV 254 nm. Saponin akan memberikan warna merah violet jika diamati pada cahaya tampak.
4. Uji Alkaloid
Fase gerak yang digunakan adalah toluena : etil asetat : dietil amin (7 : 2 : 1) dalam 2 ml. Plat KLT dideteksi semprot dengan menggunakan pereaksi Dragendorff. Plat kemudian diamati pada cahaya tampak dan UV 254 nm.
Alkaloid akan memberikan warna coklat atau jinga dibawah sinar tampak.
5. Uji Asam Lemak
Uji KLT asam lemak menggunakan penyemrot rhodamin B dalam etanol dan fase gerak benzena : dietil eter (95% : 5%) dalam 2 ml larutan. Semua jenis asam lemak dapat dideteksi dengan rhodamin B (Harborne, 1987 : Robinson, 1991). Plat kemudian diamati pada cahaya tampak dan UV 254 nm. Plat akan menunjukkan warna ungu jika sampel mengandung asam lemak pada UV 254 nm.
6. Uji Terpenoid dan Steroid
commit to user
Fase pengembang yang digunakan untuk analisa steroid dan terpenoid adalah heksana : etil asetat (95% : 5%) dalam 2 ml. Reagen penyemprot untuk steroid adalah SbCl3 dalam kloroform, sedangkan untuk terpenoid adalah larutan Lieberman Buchard. Steroid dan terpenoid akan memberikan warna ungu jika diamati pada cahaya tampak dan dibawah sinar UV 254 nm.
g. Kromatografi Gas-Spektrometer Massa (GC-MS)
Uji GC-MS dilakukan untuk megidentifikasi komponen fraksi teraktif antibakteri umbi lobak (Raphanus sativus L.) Kondisi alat GC-MS sebagai berikut:
Jenis pengion : EI (Electron Impact) Jenis kolom : Rastex RXi-5MS Panjang kolom : 30 meter
Diameter kolom : 0,25 milimeter Suhu kolom : 80 ºC
Suhu injektor : 310 ºC
Tekanan : 22,0 kPa