METODOLOGI PENELITIAN
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Isolasi Nematoda Freeliving
Tanah sumber isolat nematoda freeliving diambil dari kebun tanaman hias yang berada di sekitar gedung unit 3 Fakultas Matematika dan Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara. Tanah sekitar tanaman hias digali sedalam 10-20 cm kemudian tanah diambil sebanyak 100 g dan dimasukkan kedalam plastik zip lalu dibungkus dengan aluminium foil. Tanah lalu di simpan pada suhu 40C selama 24 jam. Tanah yang telah disimpan selama 24 jam kemudian ditabur ke petri yang berisi media Nematode Growth Medium (NGM) yang telah dibuat sebelumnya (Lampiran 1, Hlm. 46 ) sebanyak 1 g dan ditambahkan Escherichia coli sebanyak 200 μl. Petri lalu disimpan pada kondisi gelap dengan suhu 220 C- 250 C hingga ditemukan nematoda muncul pada petri. Jika ditemukan nematoda, maka nematoda akan disubkultur kembali ke media NGM yang baru dengan menggunakan metode single culture untuk memastikan nematoda pada media NGM yang baru memiliki jenis yang sama. Subkultur nematoda lalu disimpan untuk perlakuan in vitro.
3.4.2 Isolasi Jamur JPN Danau Toba
Tanah sampel diambil dengan menggali permukaan tanah atau sedimen pada danau hingga kedalaman 10-20 cm dari permukaan tanah atau sedimen danau Toba.
Sebanyak 100 g tanah dimasukkan kedalam plastik zip dan dibungkus menggunakan aluminium foil kemudian disimpan dalam coolbox. Tanah kemudian disimpan pada suhu 40 C sebelum digunakan. Sebanyak satu gram tanah sampel lalu ditabur (sprinkle
method) ke media CHF-WA yang telah dibuat sebelumnya (Lampiran 1, Hal. 46) dan disimpan pada kondisi gelap pada suhu 220 C- 250 C selama 3 hari hingga ditemukan miselium jamur yang telah tumbuh memenuhi seluruh petri. Petri isolasi tanah danau Toba yang telah ditumbuhi jamur kemudian diberi nematoda freeliving sebanyak 100 individu dan disimpan kembali pada kondisi gelap hingga ditemukan nematoda yang mati. Jika ditemukan nematoda yang mati disekitar miselium jamur, maka jamur disekitar nematoda yang mati tersebut akan disubkultur ke media CMA (Corn Meal Agar) untuk pengujian in vitro.
Gambar 3.1 Petri isolasi jamur dari sampel tanah danau Toba pada media CHF-WA.
A. Sampel tanah/sedimen; B: Suspensi nematoda freeliving 3.4.3 Skrining JPN Terhadap Nematoda Secara In Vitro
Prosedur uji skrining JPN secara in vitro dilakukan dengan mengacu pada metode percobaan Hastuti et al.,(2016) . JPN yang akan diuji ditumbuhkan pada media CMA (Corn Meal Agar) dan diinkubasi pada suhu 250 C selama 3 hari atau hingga seluruh miselia jamur memenuhi petri. Petri yang berisi miselia jamur lalu diberi suspensi nematoda freeliving sebanyak 1000 individu dan disimpan dalam ruangan gelap sambil melakukan pengamatan dan penghitungan jumlah populasi nematoda setiap 12, 24, 36, 48, dan 72 jam. Jika ditemukan jumlah kematian nematoda tinggi dan tidak ada peningkatan jumlah nematoda yang signifikan sering bertambahnya jam pengamatan maka miselia jamur tersebut akan ditumbuhkan lagi pada media Chloramphenicol Water Agar (CHF-WA) dan diberi M. hapla untuk melihat ada atau tidaknya perangkap miselia
yang terbentuk dengan menggunakan mikroskop. Jika ditemukan perangkap miselia, maka jamur akan disubkultur ke media PDA pada suhu 250C selama 14 hari.
3.4.4 Persiapan Inokulan JPN
Setiap strain jamur yang berumur 14 hari, masing-masing diambil lima blok agar masing-masing 1 cm dari setiap strain JPN. Kelima blok agar dari masing-masing strain jamur di tambahkan ke 50 g media kompos dan dedak padi berbanding 2:1 dalam Erlenmeyer 250 ml dan kemudian di inkubasi selama 14 hari pada suhu 250 C dalam keadaan gelap. Setelah 14 hari, 1 g dedak padi yang mengandung konidia jamur diambil dan ditambahkan ke dalam 9 ml air suling. Suspensi disaring melalui kain kasa lalu disentrifugasi pada 3000 rpm selama 5 menit. Pellet yang dihasilkan dari proses sentrifugasi dicampur kembali dengan air steril dan di sentrifugasi. Proses ini diulangi sebanyak 3 kali untuk mendapatkan konidia yang bersih. Suspensi konidia yang telah bersih lalu diatur konsentrasi konidianya sebanyak 1 x 107 konidia dengan menggunakan Hemasitometer. Setiap pot percobaan akan menerima sebanyak 10 ml suspensi jamur yang mengandung konidia 1 x 107 yang dimasukkan kedalam 10 g media tanah campuran kompos dan dedak padi steril dengan perbandingan 2:1 (Panjaitan et al, 2019).
3.4.5 Persiapan Juvenil 2 Meloidogyne hapla
Akar terinfeksi dengan puru akar (M. hapla) diperoleh dari kebun percobaan IPB. Akar kemudian dicuci bersih dan dipotong. Akar lalu dicuci dalam larutan kaporit (10 ml kaporit dalam 100 ml aquadest) dengan cara digoyang dengan keras/ dikocok dengan kuat selama 5 menit. Selanjutnya akar dicuci dengan air mengalir hingga bau dari larutan kaporit menghilang. Sebanyak 3 puru pada akar dipilih dan diambil menggunakan pinset. Puru akar tersebut di masukkan kedalam petri dish yang telah berisi media Nematode growth medium (NGM). Puru akar lalu diinkubasi pada suhu 250 C selama 7-10 hari pada kondisi gelap untuk menetaskan telur hingga fase Juvenil 2.
Nematoda Juvenil 2 yang sudah memenuhi petri dapat dipanen dan dihitung jumlahnya (Lampiran 1, Hlm. 46 ) untuk diinjeksikan ke tanaman percobaan. Setiap tanaman percobaan mendapatkan sebanyak 1000 individu Juvenil 2 (Hastuti dan Jane, 2018).
3.4.6 Persiapan Medium Pertumbuhan Tanaman Tomat
Medium pertumbuhan tanaman tomat yang digunakan untuk perlakuan adalah tanah dengan tanah kompos yang dicampur dengan perbandingan 2:1 (Pratiwi et al, 2017). Tanah kompos disaring dan dikeringanginkan selama empat hari kemudian di masukkan kedalam plastik tahan panas dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1200 C, 1 psi selama 50 menit. Dalam kondisi steril, tanah dipindahkan ke pot perlakuan berdiameter 10 cm dan masing masing pot berisi 300 g tanah steril. Untuk menghindari kontaminasi, semua pot yang akan diberi perlakuan ditutup dengan aluminium foil di bagian atas dan di bawah pot. Metode ini dilakukan dengan mengacu pada metode yang dilakukan oleh Hastuti dan Jane (2018). Tujuh hari sebelum tanaman tomat dipindahkan ke dalam seluruh pot perlakuan, tanah untuk perlakuan JPN dicampur dengan 10 g media campuran tanah kompos dan dedak padi steril yang telah diberi 10 ml suspensi jamur yang mengandung 1 x 107 konidia.
3.4.7 Persiapan Agen Kimia Pembanding
Agen kimia pembanding yang digunakan pada penelitian ini adalah Karbofuran (carbofuran®). Sebanyak 2 mg Karbofuran dihaluskan dan dicampur dengan 10 g tanah campuran kompos dengan dedak padi. Tanah karbofuran akan dituangkan ke dalam pot perlakuan pada tujuh hari sebelum bibit tanaman tomat dipindah kedalam masing-masing pot perlakuan (Hastuti dan Jane., 2018)
3.4.8 Uji Bioassay JPN Asal Danau Toba Dalam Mengendalikan Serangan Meloidogyne hapla pada Tanaman Tomat (Solanum lycopersicum L.)
Percobaan ini mengacu pada penelitian yang telah dilakukan oleh Hastuti dan Jane (2018). Bibit tomat (Solanum lycopersicum L.) disebarkan diatas kain lembab dan dibiarkan bekecambah. Kecambah bibit tomat yang telah berumur 3 hari dipindahkan ke nampan yang berisi tanah kompos steril. Setelah 15 hari disemai, bibit tanaman tomat dipindahkan ke pot perlakuan yang berisi medium pertumbuhan yaitu 300 g tanah kompos steril. Pot yang yang telah ditanami bibit tomat dibagi menjadi lima kelompok yaitu K(-) adalah perlakuan tanaman tomat tanpa pemberian nematoda maupun jamur, K(+) adalah perlakuan tanaman tomat diberi nematoda, KBF adalah perlakuan tanaman
tomat diberi nemastisida kimia dan nematoda, J1 adalah perlakuan tanaman tomat diberi jamur asal danau Toba dan nematoda, dan J2 adalah perlakuan tanaman tomat diberi jamur asal danau Toba dan nematoda. Masing-masing pot tanaman perlakuan diberi tiga ulangan dan lima waktu pengamatan yaitu pengamatan hari ke 7, 14, 21, 28 dan 35. Pada saat bibit tomat dipindahkan ke medium pertumbumbuhan, sebanyak 1 x 107 konidia JPN pada 10 g tanah dedak padi diberikan ke masing-masing pot perlakuan J1 dan J2.
Tujuh hari setelah tanaman tomat berada di pot perlakuan, tanah di sekitar tanaman tomat pot perlakuan K(+), KBF, J1 dan J2 diinjeksikan 1000 M. hapla fase Juvenil 2 kecuali pot K(-). Tanaman tomat dalam pot dengan berbagai perlakuan dirawat dengan menempatkan tanaman dibawah sinar matahari langsung setiap dua hari sekali agar mendapatkan kondisi cahaya dan suhu yang baik untuk pertumbuhan tanaman tomat.
3.4.9 Pengamatan dan Analisis Data
Pengamatan dimulai dengan memotong batas akar dengan batang lalu membersihkan tanah dari akar dengan mencucinya dengan air. Setelah akar bersih, akar lalu di rendam pada pewarna Phloxine B sebelum diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 10x. Pengamatan terhadap efektivitas JPN sebagai biokontrol terhadap nematoda dilakukan dengan menghitung jumlah vermiform nematoda pada akar pad tujuh hari infeksi. Pengamatan infeksi 14 dan 21 hari dilakukan dengan menghitung jumlah pembengkakan akar yang berisi nematoda betina dewasa. Pengamatan infeksi 28 dan 35 hari dilakukan dengan menghitung jumlah puru akar yang berisi nematoda betina dewasa yang telah menghasilkan telur. Pengamatan terhadap pengaruh infeksi nematoda terhadap pertumbuhan tanaman tomat dilakukan dengan cara menghitung berat basah dan berat kering batang, berat basah dan berat kering akar, tinggi batang tanaman, dan panjang akar pada masing-masing pot perlakuan berdasarkan waktu pengamatan. Hasil yang diperoleh akan didokumentasikan dan jumlah dari vermiform, bengkak akar, puru akar, panjang dan berat akar maupun batang akan dibandingkan untuk melihat perbedaan infeksi Meloidogyne hapla pada setiap pot perlakuan dan hasilnya akan dianalisis dengan ANOVA menggunakan piranti SPSS ver. 21.00 (Hastuti et al, 2018;
Hastuti dan Jane, 2018).
BAB 4