1. Persiapan Sampel
Limbah kulit dan kepala udang dipisahkan dari badannya, dibersihkan dan dicuci dengan menggunakan air. Kulit dan kepala udang direbus selama ± 15 menit, lalu ditiriskan. Selanjutnya kulit dan kepala udang dijemur dibawah sinar matahari hingga kering, lalu dihancurkan hingga menjadi bubuk halus dan siap digunakan.
2. Pembuatan Media
2.1 PembuatanPotato Extract
Sebanyak 200 gram kentang dikupas kulitnya lalu dipotong seperti dadu dan direbus dalam 1000 mL akuades selama 1 jam setelah mendidih. Setelah kondisi tercapai, disaring dengan kertas saring sehingga diperoleh ekstrak kentang yang bening. Ekstrak kentang disimpan dalam botol reagen lalu disterilisasi dengan autoclavepada suhu 121˚C dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Ekstrak kentang yang telah disterilisasi, didinginkan pada suhu kamar kemudian disimpan dalam lemari pendingin (kulkas) (DZMZ, 2015).
29
2.2 Media PDA (Potato Dextrose Agar) dan PertumbuhanMucor miehei pada Media PDA
Sebanyak 100 mLpotato extractditambahkan 4 gram dekstrosa dan 3 gram agar dalam labu Erlenmeyer 250 mL lalu disterilisasikan denganautoclavepada suhu 121˚C dan tekanan 2atm selama 20 menit (DSMZ, 2015). Setelah itu media PDA ini di-UVselama 10 menit dalamLaminar Air Flowdan dituang ke dalam cawan petri. Strain jamurMucor mieheiditumbuhkan kurang lebih selama 5 hari sampai spora jamur ini tumbuh (Alveset al., 2005).
2.3 Media PDL (Potato Dextrose Liquid) dan PertumbuhanMucor miehei pada Media PDL
Sebanyak 100 mLpotato extractditambahkan 4 gram dekstrosa dalam labu Erlenmeyer 250 mL lalu disterilisasikan denganautoclavepada suhu 121˚C dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Setelah itu media PDL ini di-UVselama 10 menit dalamLaminar Air Flow. Spora kultur 5 hari dipisahkan dan dimasukkan dalam media PDL dan diletakkan dalamshaker incubator dengan kecepatan 175 rpm pada suhu 30˚C selama ± 5 hari (Alves et al., 2005).
3. Larutan Buffer Sitrat pH 4
Sebanyak 0,96 gram asam sitrat dilarutkan dalam 50 mL akuades dalam labu takar 50 mL dan dikocok hingga homogen. Larutan ini merupakan larutan stok A. Kemudian dilarutkan sebanyak 0,65 gram natrium sitrat dalam 25 mL akuades
30
dalam labu volumetrik 25 mL dan dikocok hingga homogen. Larutan ini merupakan larutan stok B.
Sebanyak 33 mL larutan stok A (asam sitrat 0,10 M) dan 17 mL larutan stok B (natrium sitrat 0,10 M) dilarutkan dalam 100 mL akuades dalam labu volumetrik 100 mL dan kemudian dicek pH-nya. Ini merupakan larutan buffer sitrat pH 4 (Mardiana, 2002).
4. Pembuatan Media InokulumMucor miehei
Sebanyak 0,1 gram serbuk kulit udang dimasukan ke dalam labu Erlenmeyer 100 mL, kemudian ditambahkan 0,01 gram laktosa; 0,03 gram bakto pepton; 0,14 gram amonium sulfat; 0,03 gram urea; 0,2 gram kalium dihidrogen sulfat; 0,03 gram besi (II) sulfat heptahidrat; 0,03 gram kalsium klorida; dan 0,029 gram seng (II) sulfat heptahidrat, serta dilarutkan dalam 10 mL buffer sitrat pH 4.
Selanjutnya campuran diaduk sampai homogen lalu disterilisasi dalamautoclave pada suhu 121˚C dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Kemudian media
didinginkan pada suhu ruang dalamLaminar Air Flow.Sebanyak 1 mL kultur awal dari media PDL diinokulasikan ke dalam media ini dan difermentasi pada 30˚C dalamshaker-incubatordengan kecepatan 250 rpm selama 7 hari (Chahalet al., 2001).
31
5. Fermentasi Fase Cair Sistem Tertutup (Batch) denganMucor miehei
Fermentasibatchdilakukan dengan menggunakanShaker Incubatorsistem tertutup. Substrat yang digunakan adalah serbuk kulit udang. Sebanyak 1 gram serbuk kulit udang dimasukkan dalam labu erlenmeyer 100 ml yang berisi 0,01 gram laktosa; 0,03 gram bakto pepton; 0,14 gram amonium sulfat; 0,03 gram urea, 0,2 gram kalium dihidrogen sulfat; 0,03 gram besi (II) sulfat heptahidrat; 0,03 gram kalsium klorida; dan 0,029 gram seng (II) sulfat heptahidrat, serta dilarutkan dalam 10 mL buffer sitrat pH 4. Media fermentasi ini dibuat 5 replikat.
Selanjutnya media disterilisasi dengan autoklaf pada 2 atm temperatur 121oC selama 20 menit. Kemudian media didinginkan pada suhu ruang dalamLaminar Air Flow.Sebanyak 10 mLstarterdiinokulasikan ke dalam media ini dan difermentasi pada 30˚C dalam shaker-incubatordengan kecepatan 250 rpm selama 1-5 hari (Chahalet al., 2001).
Sejumlah hasil dari fermentasi batch, pada tiap selang waktu 1 hari, dipanaskan denganwaterbathpada suhu 70oC selama 45 menit. Kemudian dicampurkan dengan 5 ml akuades dengan membiarkan labu erlenmeyer padarotary shaker selama 1 jam pada 200 rpm. Campuran disaring menggunakan kertas saring dan filtrat disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit pada suhu 4oC. Semua filtrat yang diperoleh, dibekukan dalamfreezerselama 24 jam.
32
6. Analisis Glukosamin dengan Spektrometer UV-Vis
Analisis glukosamin menggunakan spektromoter ultraviolet-visible (UV-Vis) dilakukan setelah didapat filtrat hasil fermentasi.
6.1 Pembuatan Standar Glukosamin
Sebanyak 0,05 gram glukosamin (Glc) standar WAKO dilarutkan dalam 50 ml akuades dalam labu ukur diperoleh konsentrasi akhir 1000 mg/L. Kemudian larutan glukosamin standar 1000 mg/L ini diencerkan hingga diperoleh konsentasi akhir msing-masing 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, dan 150 mg/L. Dari berbagai konsentrasi larutan standar ini, masing-masing diambil 4 ml lalu ditambahkan 0,5 ml larutan ninhidrin 0,8 % dan 0,5 ml larutan buffer fosfat pH 6. Larutan ini kemudian dipanaskan pada 100oC dalam penangas selama 15 menit. Setelah terbentuk warna ungu, larutan didiamkan dalam suhu kamar dan diukur dengan spektrofotomer UV-Vis pada panjang gelombang 570 nm (Wuet al., 2005).
6.2 Pembuatan Sampel Glukosamin
Filtrat hasil fermentasi masing-masing diambil dan diencerkan sebanyak 30 kali dengan akuades. Larutan tersebut diambil 4 ml lalu ditambahkan 0,5 ml larutan ninhidrin 0,8 % dan 0,5 ml larutan buffer fosfat pH 6. Larutan ini kemudian dipanaskan pada 100oC dalam penangas selama 15 menit. Reaksi antar
33
suhu kamar dan diukur dengan spektrofotomer UV-Vis pada panjang gelombang 570 nm.
6.3 Pemilihan Panjang Gelombang Maksimum
Pemilihan panjang gelombang (λ) maksimumdilakukan menggunakan larutan glukosamin standar dan hasil fermentasi yang telah direaksikan dengan larutan ninhidrin 0,8% dan buffer fosfat pH 6. Kemudian dilakukanscanning
menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada rentang panjang gelombang (λ) 450-600 nm.
6.4 Kalibrasi Glukosamin Sampel
Absorbansi glukosamin dalam sampel dikalibrasikan dengan kurva glukosamin (Glc) standar menggunakan persamaan regresi linear. Hasil yang diperoleh dikalikan dengan faktor pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi glukosamin dalam larutan hasil fermentasi tiap selang waktu 5 hari.
47
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan sebagai berikut.
1. Mucor mieheimemiliki potensi untuk mendegradasi kulit udang menjadi glukosamin tanpa harus merubahnya menjadi kitin.
2. Waktu inkubasi optimum fermentasi kulit udang denganMucor mieheiadalah hari keempat dengan kadar kemurnian glukosamin dalam sampel kulit udang, yaitu pada hari keempat sebesar 4,1442 %.
3. Kadar kemurnian glukosamin yang dihasilkan dengan menggunakan substrat kulit udang lebih rendah dibandingkan dengan kitin karena masih terkandung protein dan mineral lain.
4. Reagen ninhidrin memberikan reaksi positif terhadap glukosamin sehingga dapat digunakan untuk analisis spektrofotometri UV-Vis.
47
B. Saran
Dari hasil penelitian yang diperoleh, maka disarankan untuk memvalidasi adanya glukosamin dalam produk fermentasi menggunakan HPLC-ELSD agar didapat hasil kromatogram kemurnian glukosamin, serta melakukan proses deproteinasi dan demineralisasi agar kadar glukosamin maksimal.
44