METODOLOGI PENELITIAN
3.10 Prosedur penelitian .1 Pengumpulan data
1. Perempuan hamil (20-45 tahun) yang mendapatkan acetylsalisilic acid (ASA) dosis rendah (80-100 mg) yang memenuhi kriteria penelitian diminta kesediaannya untuk ikut serta dalam penelitian.
2. Subjek yang bersedia ikut serta dalam penelitian, diminta persetujuannya dalam bentuk informed consent tertulis. Pada calon subjek penelitian satu persatu diberikan penjelasan secara lisan dan tulisan tentang tujuan, manfaat dan prosedur penelitian.
3. Pada saat subjek mengalami persalinan, dilakukan pengambilan sampel selaput ketuban di rumah sakit/klinik tempat subjek melakukan persalinan untuk dilakukan pemeriksaan makroskopis selaput ketuban.
4. Kemudian dilakukan fiksasi jaringan selaput ketuban dan dibawa ke laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi dan imunohistokimia fibronektin.
3.10.2 Prosedur perlakuan jaringan
Setelah menentukan daerah yang ruptur pada selaput ketuban, dibuat daerah dengan lebar sekitar 10 cm. Dengan menggunakan forsep, bagian yang mewakili daerah ruptur dipegang lalu selaput digulung dengan ketentuan bagian
selaput ketuban. Kemudian gulungan jaringan tersebut difiksasi dan dilakukan pengirisan.
Gambar 3.2 Pembuatan gulungan selaput ketuban (dikutip dari Benirschke and Kaufmann, 2006)
3.10.3 Prosedur pembuatan sediaan histopatologi a. Fiksasi
− Jaringan dimasukkan ke dalam larutan neutral buffered formalin, dan difiksasi selama 18-24 jam.
− Setelah itu, jaringan dimasukkan ke dalam larutan aquadest selama 1 jam; ini bertujuan untuk penghilangan larutan fiksasi.
b. Dehidrasi
− Potongan jaringan dimasukkan dalam alkohol konsentrasi bertingkat 70%, 80%, 90% (masing-masing 1 hari) alkohol 95%
selama 2 hari, 2 kali pergantian alkohol 100% selama 2 hari, 2 kali pergantian
c. Penjernihan (clearing)
− Jaringan direndam di dalam larutan xylol sebanyak 20 kali volume jaringan, selama 2 x 15 menit.
d. Pembenaman/ infiltrasi (Impregnasi)
− Jaringan dimasukkan ke dalam parafin cair dan disimpan di oven yang bersuhu 60⁰C, selama 3 x 1 jam.
e. Pengecoran (Blocking)
− Parafin dituang secukupnya pada cetakan, kemudian letakkan jaringan pada dasar cetakan dan beri label.
f. Pengirisan (Sectioning)
− Blok paraffin diiris dengan mikrotom dengan ketebalan potongan ± 5-10 µm
− Atur jarak preparat yang dipegang holder kearah pisau sedekat mungkin
− Gerakkan rotor pada mikrotom secara ritmis searah jarum jam.
− Buang pita parafin awal yang tanpa jaringan.
− Setelah irisan mengenai jaringan, iris blok paraffin hati-hati.
− Pita paraffin yang diinginkan dipindahkan dengan sengkelit ke atas air dalam waterbath suhu 55⁰C
− Setelah pita parafin terkembang dengan baik, tempelkan pada kaca objek yang telah disalut (50 ml albumin + 50 ml gliserin + sedikit timol dan disimpan pada refrigerator bersuhu 4⁰C)
− Kaca objek yang berisi pita paraffin dibiarkan mengering semalaman pada suhu kamar.
g. Pewarnaan dengan Haematoxylin dan Eosin
− Jaringan pada kaca objek dilakukan deparafinisasi dengan xylol selama 2x2 menit.
− Hidrasi dengan alkohol 100% (selama 2x2 menit); alkohol 95%
(selama 2 menit); 90% (selama 2 menit), 80% (selama 2 menit);
70% (selama 2 menit); air kran (selama 3 menit).
− Inkubasi dalam larutan Haematoxylin Mayer selama beberapa menit.
− Cuci dalam air kran mengalir selama 15-20 menit.
− Observasi di bawah mikroskop, bila masih terlalu biru cuci lagi dengan air mengalirbbeberapa menit. Bila sudah cukup warna lanjutkan dengan counterstaining.
− Counterstaining dengan Eosin working solution beberapa menit.
− Dehidrasi dengan larutan alkohol dengan gradasi peningkatan persentase dari 70%, 80%, 90%, 95%, 100% (masing-masing selama 2 menit).
− Inkibasi dengan Xylol 2x masing-masing selama 2 menit.
− Mounting dengan Entellan TM
− Beri label dan biarkan hingga entellan mongering. Hasil pewarnaan pada inti berwarna biru dan sitoplasma berwarna kemerahan.
balsam Kanada dan cover glass.
3.10.4 Pembacaan/interpretasi sediaan (slide) histologi (pengukuran ketebalan jaringan)
Ketebalan lapisan kolagen pada jaringan selaput ketuban diukur dengan menggunakan mikroskop Primostar ZEISS yang dilengkapi kamera Axiocam
ERc5s. Tiap sediaan diperiksa pada 3 area (dengan arah jam 12; teknik Fujikura) (Benirschke and Kaufmann, 2006) yang masing-masing mewakili tiap lapisan dari gulungan selaput ketuban.
Prosedur pembacaan dilakukan sebagai berikut: Setelah sediaan diletakkan di mikroskop, dipilih lapang pandang dengan pembesaran 10 kali. Pada monitor komputer yang dilengkapi software Axiovision Rel. 4.8.2 (06-2010) tampak beberapa MENU pilihan. Pada toolbar tampak MENU Live, lalu ditentukan area yang akan diukur, pilih MENU Snap kemudian Measure. Dari menu ini dipilih option Length dan dengan menggunakan mouse tarik garis dari batas bawah epitel aminon sampai batas bawah membran basal korion pada daerah yang berwarna merah sesuai dengan gambaran kolagen dari pewarnaan tersebut. Hasil tersebut adalah ketebalan kolagen pada lapisan amnion dan korion.
Data gambar dan hasil pembacaan kemudian disimpan dalam file.
3.10.5 Prosedur pembuatan sediaan (slide) imunohistokimia
1. Dilakukan deparafinisasi sediaan dengan memasukkan sediaan ke dalam larutan xylol 1, xylol 2 dan xylol 3 selama masing-masing 5 menit
2. Kemudian dilakukan proses rehidrasi untuk menghilangkan sisa xylol dengan menggunakan larutan alkohol absolut, alkohol 90%, alkohol 80%, alkohol 70% selama masing-masing 4 menit
3. Lalu sediaan dicuci di bawah air mengalir selama 5 menit
4. Masukkan sediaan ke dalam mesin pengering merk PT Link Dako Epitop Retrieval lalu diatur set up preheat 65 ⁰C, running time 98⁰ C selama 15 menit . Tunggu sampai ±1jam sampai sediaan kering.
5. Selanjutnya jaringan pada sediaan dilingkari dengan spidol Pap pen agar pada saat penetesan antibody atau cairan lainnya tidak keluar melewati batas lingkaran Pap pen. Kemudian segera dimasukkan ke dalam larutan Tris Buffered Saline (TBS) pH 7,4 selama 5 menit 6. Kemudian dilakukan blocking dengan peroksidase selama 5-10 menit
dan dicuci TBS pH 7,4 selama 5 menit
7. Selanjutnya dilakukan blocking dengan Normal Horse Serum (NHS 3%) selama 15 menit dan dicuci dengan TBS pH 7,4 selama 5 menit 8. Jaringan pada sediaan ditetesi antibodi primer (antibodi anti-Human
fibronectin purified clone FN-3 eBioscience
9. Lalu dicuci kembali dengan TBS pH 7,4 dan Tween 20 selama 5 menit
) dengan pengenceran 1 : 100 dan di-inkubasi selama 1 jam
10. Selanjutnya jaringan pada sediaan ditetesi Dako Real Envision Rabbit/Mouse dan inkubasi selama 30 menit dan kembali dicuci dengan TBS pH 7,4 dan Tween 20 selama 5 -10 menit)
11. Jaringan pada sediaan ditetesi Diamino Benzidine (DAB)+substrat chromogen solution dengan pengenceran 20 µl DAB: 1000 µl substrat dan diinkubasi selama 5 menit lalu dicuci kembali dengan air mengalir 12. Selanjutnya dilakukan pewarnaan dengan Hematoxylin selama
10 menit
13. Cuci dibawah air mengalir selama 5 menit dan celupkan sediaan ke dalam lithium karbonat (5% dalam aqua) selama 2 menit dan cuci kembali di bawah air mengalir selama 5 menit
14. Selanjutnya dilakukan proses pengeringan melalui proses dehidrasi dengan menggunakan alkohol 80%, alkohol 90% dan alkohol absolut selama masing-masing 5 menit
15. Kemudian dilakukan clearing dengan menggunakan larutan xylol 1, xylol 2 dan xylol 3, masing-masing 5 menit
16. Selanjutnya dilakukan mounting dan tutup sediaan dengan coverglass dan sediaan siap untuk dinilai. (Singapore General Hospital/SGH methode)
3.10.6 Pembacaan/interpretasi sediaan (slide) imunohistokimia (tampilan fibronektin pada jaringan)
Setelah sediaan diletakkan pada mikroskop, dipilih pembesaran 4x untuk menilai luas tampilan dan pembesaran 100x untuk menilai intensitas pewarnaan.
Penilaian tampilan pewarnaan imunohistokimia fibronektin sebagai berikut:
− Kontrol positif digunakan jaringan human plasenta normal yang berfungsi sebagai pembanding tampilan warna coklat yang terwarnai dari hasil pewarnaan imunohistokimia.
− Sediaan yang tertampil warna coklat pada membran sitoplasma dikatakan positif dan negatif bila tidak tertampil warna coklat.
− Penilaian intensitas pewarnaan dengan cara membandingkan sediaan sampel penelitian dengan sediaan kontrol.
Intensitas tampilan :
0 = tidak tertampil warna coklat/negatif
1 = tampilan warna coklat yang tertampil lemah 2 = tampilan warna coklat yang tertampil sedang 3 = tampilan warna coklat yang tertampil kuat
Luas tampilan :
1 = luas tampilan warna coklat yang tertampil< 25%
2 = luas tampilan warna coklat yang tertampil 25-50%
3 = luas tampilan warna coklat yang tertampil >50%
Tampilan imunohistokimia : 0 = negatif
1 - 3 = tampilan lemah 4 - 6 = tampilan sedang 7 - 9 = tampilan kuat
3.10.7 Keandalan
− Pengukuran ketebalan selaput ketuban dilakukan oleh peneliti dengan koefisien variasi < 10%.
− Penilaian/pembacaan sediaan imunohistokimia dilakukan oleh peneliti dan satu orang ahli patologi anatomi dengan cara tersamar. Inter-rater reliability (keandalan antar pemeriksa) ditetapkan dengan perbedaan tidak lebih dari satu tingkat skor.