METODE PENELITIAN 3.1Alat – Alat
3.3 Prosedur Penelitian .1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan pidada merah yang diperoleh dari desa bagan pekan, Kec.Tanjung Balai,Kab.Asahan. Daun tumbuhan pidada merah ini dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan pidada merah sebanyak 1500 gram.
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun tumbuhan Pidada Merah Serbuk daun pidada merah diidentifikasi dengan menggunakan cara:
1. Skrining fitokimia
3.3.2.1 Skrining Fitokimia
Untuk mengetahui adanya senyawa flavonoida pada daun tumbuhan pidada merah, maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif sebagai berikut :
- Dimasukkan ± 10 gram daun tumbuhan pidada merah (Soneratia caseolaris L.) yang telah dikeringkan dan dipotong-potong kecil ke dalam erlenmeyer
- Ditambahkan metanol ± 100 ml - Didiamkan
- Disaring
- Dibagi ekstrak metanol ke dalam 4 tabung reaksi - Ditambahkan masing-masing pereaksi
a. Tabung I : dengan FeCl3
b. Tabung II : dengan H
5% menghasilkan larutan berwarna hitam
2SO4(p)
c. Tabung III : dengan Mg-HCl menghasilkan larutan berwarna merah muda menghasilkan larutan orange kekuningan
d. Tabung IV : dengan NaOH 10% menghasilkan larutan berwarna biru violet
3.3.2.2 Analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fasa diam silika gel 60(0,063-0,200 mm)
- Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak n-heksana : etil asetat (90:10)v/v ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan.
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. Pelarut yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana : etil asetat. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90:10 ; 80:20 ; 70:30 ; 60:40 ; 50:50 v/v ).Cara menganalisis kromatografi Lapis tipis sebagai berikut:
- Ditotolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi pelarut yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi. Plat yang telah dielusi dikeluarkan dari bejana, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%.
- Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (80 :20)v/v; (70:30)v/v; 60:40)v/v ; dan 50:50 v/v.
Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa di dalam daun pidada merah terkandung senyawa flavonoida. Hasil pemisahan yang baik diberikan pada fase gerak n-heksana : etil asetat (50:50)v/v
3.3.3 Prosedur Memperoleh Ekstrak Pekat Lapisan Metanol dari Daun Tumbuhan Pidada Merah (Soneratia caseolaris L.)
Serbuk daun tumbuhan pidada merah ditimbang sebanyak 1500 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 10 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama ± 4 hari. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemblokan tannin dengan cara melarutkan fraksi metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian dirotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi etil asetat dilarutkan dengan metanol dan dipartisi berulang-ulang dengan n-heksana. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol sebanyak 18,96 g.
3.3.4 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 60G (0,063-0,200 mm) dan fasa gerak yaitu n-heksana 100%, campuran pelarut n-heksana : etil asetat dengan perbandingan (90:10)v/v, (80:20)v/v, (70:30)v/v, (60:40)v/v, dan (50:50)v/v. Cara mengisolasi senyawa flavonoida dengan Kromatografi kolom sebagai berikut:
- Dirangkai alat kolom kromatografi. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60G (0,063-0,200 mm) dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi.-
- Dimasukkan18.96 g ekstrak pekat metanol daun pidada merah ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana : etil asetat (90 : 10) v/v secara perlahan – lahan, dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas.
- Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n – heksana : etil asetat dengan perbandingan ( (50:50)v/v. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap 5 ml , lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl3
- Diuapkan sampai terbentuk kristal. 5%.
3.3.5 Pemurnian (Rekristalisasi)
Kristal yang diperoleh dari isolasi dilarutkan kembali dengan etil asetat,diaduk hingga semua kristal larut sempurna. Kemudian ditambahkan etil asetat(pa)
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
secara perlahan–lahan hingga terjadi pengendapan zat-zat pengotor di dasar wadah. Kemudian didekantasi larutan bagian atas wadah, lalu diuapkan sisa pelarut dari kristal hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut.
Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang diperoleh dari fraksi 51-60 dengan fase gerak n-heksana : etil asetat (50:50) v/v pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3
3.3.7 Penentuan Titik Lebur
5% dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.
Hasil isolasi yang telah murni dimasukkan ke dalam alat pengukur titik lebur, diatur suhu. Lalu diamati suhu sampai kristal melebur.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan metanol sebagai pelarut. (Gambar 1).
3.3.8.2. Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR)
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang. (Gambar 2).
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1
Analisis dengan alat Spektrometer H-NMR)
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia - LIPI, Kawasan PUSPIPTEK Serpong, Tangerang dengan menggunakan aseton sebagai pelarut. (Gambar 3).