METODE PENELITIAN
2.5 Prosedur Penelitian 3.3.1 Penyediaan Sampel
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun benalu kakao(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) yang diperoleh dari pohon kakao yang berada didaerah Kelurahan Barisan Pansur Nauli, Kecamatan Siantar Marihat, Kota Madya Siantar, Sumatera Utara. Daun benalu pohon kakao dipisahkan dari batang dan buahnya. Sampel dikeringkan dalam ruangan selama 5 hari kemudian dihaluskan dengan blender kemudian dihitung kadar airnya.
3.3.2 Pembuatan Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan N-Heksana Daun Benalu Kakao (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
Ditimbang serbuk daun benalu kakao(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) sebanyak masing-masing 200 g, dimaserasi dengan 2 liter metanol destilat, etil asetat dan n-heksana selama 2x24 jam. Kemudian disaring. Dilakukan beberapa kali pengulangan hingga larutan berwarna jernih. Filtrat yang diperoleh dirotari evaporator dan ekstrak pekat metanol, etil asetat dan n-heksana yang diperoleh dipekatkan kembali pada penangas air sampai diperoleh ekstrak yang bebas dari pelarut metanol, etil asetat dan n-heksana dan ditimbang.
3.3.3 Uji Skrining Fitokimia 3.3.3.1Uji Alkaloida
Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) masing-masing dimasukkan dalam 4 tabung reaksi. Tabung I ditetesi pereaksi Wagner, jika terbentuk endapan jingga, maka positif mengandung alkaloida. Tabung II ditetesi pereaksi Maeyer, jika terbentuk endapan putih, maka positif mengandung alkaloida. Tabung III ditetesi pereaksi Bouchardat, jika terbentuk endapan cokelat, maka positif mengandung alkaloida dan tabung IV ditetesi pereaksi Dragendorf, jika terbentuk endapan jingga, maka positif mengandung alkaloida.
3.3.3.2Uji Flavonoida
Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksanadaun benalu kakao (Dendrophthoepentandra (L.) Miq.) masing-masing dimasukkan dalam 2 tabung reaksi. Tabung I ditetesi NaOH 10%, jika terbentuk larutan warna biru violet maka positif mengandung flavonoida. Tabung II ditambah serbuk Mg dan HCl pekat, jika terbentuk larutan warna jingga maka positif mengandung flavonoida.
3.3.3.3Uji Tanin
Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian ditambah dengan FeCl3 5%. Jika terbentuk larutan warna biru kehitaman maka
positif mengandung tanin.
3.3.3.4Uji Terpenoida
Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao(Dendrophthoepentandra (L.) Miq.) masing-masing dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian ditambah dengan CeSO41% dalam H2SO4 10%. Jika
terbentuk endapan warna merah kecokelatan maka positif mengandung terpenoida.
3.3.3.5Uji Saponin
Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao(Dendrophthoepentandra (L.) Miq.) masing-masing ditambah 10 ml aquades, kemudian dikocok kuat-kuat. Jika muncul busa yang stabil maka positif mengandung saponin.
3.3.4 Uji Sifat Antioksidan Daun Benalu Kakao (Dendrophthoe pentandra
(L.) Miq.)
3.3.4.1Pembuatan Larutan DPPH 0,3 mM
Larutan DPPH 0,3 mM dibuat dengan melarutkan 11,85 g serbuk DPPH dengan etanol p.a dalam labu takar 100 ml, kemudian dihomogenkan.
3.3.4.2Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan N- Heksana Daun BenaluKakao (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao dibuat larutan induk 1000 ppm, dengan melarutkan 0,025 g ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana dengan pelarut etanol p.a dalam labu takar 25 ml. Kemudian dari larutan induk 1000 ppm dibuat larutan 100 ppm. Dari larutan 100 ppm dibuat variasi konsentrasi 20 ppm, 40 ppm, 60 ppmdan 80 ppm untuk diuji aktivitas antioksidannya.
3.3.4.3Uji Aktivitas Antioksidan
a. Uji Aktivitas Antioksidan Larutan Blanko
Sebanyak 2,5 ml etanol absolut ditambahkan 1 ml larutan DPPH 0,3 mM dalam tabung reaksi, dihomogenkan dan dibiarkan selama 30 menit pada ruang gelap. Kemudian diukur absorbansinya dengan panjang gelombang 515 nm.
b. Uji Aktivitas Antioksidan Sampel
Sebanyak 5 ml ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao (Dendropthoe pentandra (L.) Miq.) ditambahkan dengan 1 ml larutan DPPH 0,3 mM dalam tabung reaksi, dihomogenkan dan dibiarkan dalam ruang gelap selama 30 menit. Lalu diukur absorbansinya dengan panjang gelombang maksimum 515 nm. Dilakukan perlakuan yang sama untuk konsentrasi 40, 60 dan 80 ppm.
3.3.4.4Pembuatan Variasi Konsentrasi Vitamin C
Vitamin C dibuat larutan induk 1000 ppm, dengan melarutkan 0,025 g vitamin C dengan pelarut etanol p.a dalam labu takar 25 ml. Kemudian dari larutan induk 1000 ppm dibuat larutan 100 ppm. Dari larutan 100 ppm dibuat variasi konsentrasi 5 ppm, 10 ppm, 15 ppm dan 20 ppm untuk diuji aktivitas antioksidannya.
3.3.4.5Uji Aktivitas Antioksidan Vitamin C
Sebanyak 0,5 mg vitamin C ditambahkan dengan 1 ml larutan DPPH 0,3 mM dalam tabung reaksi, dihomogenkan dan dibiarkan dalam ruang gelap selama 30 menit. Lalu diukur absorbansinya dengan panjang gelombang maksimum 515 nm. Dilakukan perlakuan yang sama untuk konsentrasi 10, 15 dan 20 ppm.
3.3.5 Uji Sifat Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan n-Heksana Daun Benalu Kakao (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
3.3.5.1Pembuatan Media NutrientAgar (NA)
Sebanyak 7 g nutrient agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 250 ml aquadest dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Lalu disterilkan di autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
3.3.5.2Pembuatan Media Agar Miring dan Stok Kultur Bakteri
Kedalam tabung reaksi yang steril dimasukkan 3 ml media nutrient agar steril, didiamkan pada temperatur kamar sampai memadat pada posisi miring membentuk sudut 30-45o. Biakan bakteri Staphylococcus aureus dari strain utama diambil dengan jarum ose steril lalu diinokulasikan pada permukaan media nutrient agar miring dengan cara menggores, kemudian diinkubasi pada biakan bakteri.
3.3.5.3Pembuatan Media Mueller Hinton Agar (MHA)
Sebanyak 19 g serbuk Mueller Hinton Agar dimasukkan dalam erlenmeyer lalu dilarutkan dalam 500 ml aquadest dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih. Disterilkan di autoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit.
3.3.5.4Penyiapan Inokulum Bakteri
Sebanyak 3,25 g Nutrient Broth dilarutkan dengan 250 ml aquadestdalam erlenmeyer dan dipanaskan hingga semua larut dan mendidih, kemudian disterilkan diautoklaf pada suhu 121oC selama 15 menit dan didinginkan. Lalu koloni bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok kultur menggunakan jarum ose steril kemudian disuspensikan ke dalam 10 ml media nutrient broth steril dalam tabung reaksi dan diinkubasikan pada suhu 35 ± 20oC selama ± 3 jam, lalu dibandingkan kekeruhannya dengan kekeruhan standar mcfarland. Hal yang sama juga dilakukan untuk koloni bakteriStaphylococcus aureusdan Escherichia coli.
3.3.5.5Pembuatan Variasi Konsentrasi Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan n- Heksana Daun Benalu Kakao (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) Ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao(Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.) dibuat dalam berbagai konsentrasi dengan menimbang ekstrak masing-masing sebanyak 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg dan 500 mgkemudian dilarutkan masing-masing 1 ml DMSO. Konsentrasi ekstrak adalah 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 300 mg/ml, 350 mg/ml, 400 mg/ml, 450 mg/ml dan 500 mg/ml.
3.3.5.6Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metanol, Etil Asetat dan n-Heksana Daun Benalu Kakao (Dendrophthoe pentandra (L.) Miq.)
Sebanyak 0,1 ml inokulum Staphylococcus aureus dimasukkan ke dalam cawan petri steril, setelah itu dituang media Mueller Hinton Agar sebanyak 15 ml dengan suhu 45-50oC dihomogenkan sampai media dan bakteri tercampur rata, kemudian dibiarkan sampai memadat. Dimasukkan kertas cakram yang telah direndam dengan ekstrak metanol, etil asetat dan n-heksana daun benalu kakao dengan berbagai variasi konsentrasi kedalam cawan petri yang telah berisi bakteri, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada suhu 35 ± 2oC selama 18 jam. Selanjutnya diukur diameter zona hambat di sekitar kertas cakram dengan jangka sorong. Dilakukan dengan cara yang sama terhadap bakteri Escherichia coli.
