METODOLOGI PENELITIAN 3.1 LOKASI PENELITIAN
3.4 PROSEDUR PENILITIAN .1 Prosedur Purifikasi Gliserol
Gliserol disiapkan dalam suatu beaker glass, lalu dipanaskan pada suhu 60
0
C selama ` jam untuk menguapkan kandungan metanol yang masih terdapat pada gliserol, setelah itu ditambahkan H3PO4 5 % sehingga terbentuk 2 lapisan, dimana lapisan bawah adalah gliserol murni dan lapisan atas adalah senyawa yang terdapat pada crude gliserol dan menghasilkan pH 2. Larutan gliserol yang sudah diperoleh dari pemisahan ditambahkan larutan NaOH hingga pH gliserol netral (pH 7). Kemudian dipanaskan supaya terbentuk garam Na3PO4 dan disaring untuk memisahkan garam dengan gliserol. Larutan gliserol kemudian ditambahkan dengan karbon aktif 2 % dari berat total gliserol untuk mengurangi warna pada gliserol tersebut, dipanaskan pada suhu 80 ℃ dan dibiarkan selama 12 jam dan disaring untuk memisahkan karbon aktif dengan gliserol.
1. Crude Gliserol di masukkan ke wadah dan dipanaskan pada suhu 60 0C untuk menguapkan alkohol yang masih terkandung..
2. Ditambahkan dengan H3PO4 5 % sebanyak 50 ml untuk setiap 150 ml Crude Gliserol sehingga menghasilkan pH 2 dan dibiarkan selama 30 menit.
3. Setelah terbentuk 2 lapisan, dipisahkan, dimana lapisan bawah gliserol dan lapisan atas senyawa yang lain selain gliserol.
4. Gliserol yang didapat ditambahkan NaOH hingga pH netral (pH 7), lalu dipanaskan dan disaring.
5. Gliserol yang didapat ditambahkan karbon aktif 2 % dan dibiarkan selama 12 jam dan dipanaskan, lalu disaring.
[33], [7], [21]
3.4.2 Prosedur Analisa Gliserol (Metode SNI)
Gliserol sebanyak 0,5 g dilarutkan dalam 50 ml air akuades lalu ditambah indikator biru bromtimol sebanyak 5 tetes. Larutan kemudian diasamkan dengan
H2SO4 0,2 N sampai terbentuk warna kuning kehijauan. Larutan dinetralkan dengan NaOH 0,05 N secara hati-hati sampai terbentuk warna biru. Setelah itu, larutan tersebut ditambah NaIO4 sebanyak 50 ml lalu diaduk secara perlahan. Larutan selanjutnya ditutup dan didiamkan dalam ruangan gelap pada suhu kamar selama 30 menit. Larutan kemudian ditambah etilena glikol sebanyak 10 ml lalu ditutup dan didiamkan dalam ruangan gelap pada suhu kamar selama 20 menit. Larutan diencerkan dengan 300 ml air akuades kemudian ditambah 3 tetes indikator biru bromtimol. Larutan hasil campuran tersebut ditirasi perlahan-lahan dengan NaOH 0,5 N sampai terbentuk warna biru. Proses tersebut juga dilakukan untuk perlakuan blangko. Kadar gliserol dihitung dengan rumus :
Kadar Gliserol (%) = �T1- T2� × N × 9,209W
(3.1) dimana :
T1 = volume NaOH untuk titrasi contoh (ml) T2 = volume NaOH untuk titrasi blangko (ml) N = normalitas NaOH
W = bobot contoh (g) Faktor gliserol = 9,209 [34]
3.4.3 Penentuan Kadar Free Fatty Acid (FFA) Gliserol
Penentuan kadar asama lemak bebas (FFA) berdasarkan langkah-langkah berikut [35] :
1. Sampel sebanyak 20 gram dimasukkan kedalam erlenmeyer dan di larutkan dengan 100 ml etanol 95 %.
2. Dikocok hingga rata, dan diambil 10 ml untuk dianalisa.
3. Campuran larutan ditambahkan 3 tetes indikator phenolphalein.
4. Campuran dititrasi dengan 0,1 N natrium hidroksida sambil diaduk hingga berubah warna menjadi merah muda selama 30 s.
5. Persentase FFA dihitung dengan persamaan :
% FFA= Normalitas NaOH x Volume NaOH terpakai x BM Gliserol
3.4.4 Penentuan Densitas Gliserol
Piknometer terlebih dahulu dikalibrasi dengan air pada suhu 30℃, dimana piknometer diisi air hingga penuh, lalu dicatat berat air untuk menghitung volume piknometer yang digunakan. Dimasukkan sampel ke dalam piknometer hingga penuh kemudian dilakukan penimbangan piknometer yang telah berisi sampel sampai menunjukkan angka yang konstan. Penentuan densitas dihitung berdasarkan persamaan berikut:
Volume Piknometer= Berat Air
Densitas Air (3.3) Volume Piknometer= Berat Sampel
Volume Piknometer (3.4) 3.4.5 Penentuan Kadar Air Gliserol
Sebanyak 10 gram sampel dimasukkan kedalam cawan penguap. Sampel dalam cawan tersebut dipanaskan di dalam oven pada suhu 105℃ selama ± 3 jam lalu didinginkan di dalam desikator yang berisi silica gel selama 30 menit dan ditimbang beratnya sampai menunjukkan angka timbangan yang konstan. Kadar air dari sampel dihitung dengan persamaan berikut:
%Kadar Air= Berat sampel-Berat setelah di panaskan
Berat sampel x 100 % (3.5)
3.4.6 Penentuan Kadar Abu Gliserol (A.O.C.S. Official Method Ca 11-55) Cawan penguap yang telah di panaskan di dalam oven pada suhu 105 ℃
selama 60 menit dan didinginkan dalam desikator selama 30 menit dan ditimbang berat kosongnya. Sampel sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam cawan penguap lalu di panaskan ke dalam furnace pada suhu 550-650 ℃ selama 3 jam, lalu didinginkan dan dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit. Ditimbang beratnya sampai menunjukkan angka timbangan yang kostan. Kadar abu dari sampel dapat dihitung dengan persamaan berikut [36]:
(3.6) sampel berat cawan berat sampel berat cawan berat Abu Kadar = ( + )−
3.4.7 Pembuatan Media Pertumbuhan
Pembuatan media pertumbuhan bakteri dilakukan dengan cara sebagai berikut. Unsur Mikro : 20 gr FeCl3.6 H2O, 10 gr CaCl2 H2O, 0,03 gr CuSO4.5 H2O, 0,05 gr MnSO4.4 H2O, 0,1 ZnSO4.7H2O dilarutkan di dalam 1 liter aquadest. Kedalam larutan, unsur mikro ditambahkan seperti (NH4)2SO4 0,5 gr, MgSO4.7H2O 0,4 gr, Na2SO4 9,65 gr, KH2PO4 2,65 gr. Ditambahkan nutrisi tambahan seperti ekstrak sapi 3 gr, pepton 3 gr, margarin 10 gr, 10 gr glukosa. Larutan pertumbuhan media kemudian diukur pHnya. pH larutan harus antara 6,4-7,4, jika larutan dalam keadaan asam maka diberikan larutan NaOH tetes demi tetes hingga mencapai pH yg telah ditentukan. Jika larutan dalam keadaan basa maka ditambahkan HCl tetes demi tetes hingga mencapai pH yang sesuai. Larutan kemudian dipanaskan sampai mendidih dan dibiarkan dingin, kemudian larutan yang terdapat di dalam erlenmeyer ditutup menggunakan kapas dan dibungkus dengan kertas serta diikat menggunakan karet, kemudian disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 selama 20 menit [20].
3.4.8 Pembuatan Kultur Stok
Tempat pembuatan kultur stok terlebih dahulu disterilisasi dengan sinar UV selama 30 menit. Kultur stok dibuat dengan mengambil kultur Enterobacter aerogenes kemudian dimasukkan dalam media pertumbuhan, kemudian diinkubasi dalam inkubator statis selama 3 hari pada temperatur 37 0C. Kultur kemudian dapat digunakan dalam fermentasi [21].
3.4.9 Perhitungan Jumlah Bakteri
Untuk mengetahui jumlah bakteri yang tumbuh dapat dilakukan dengan cara yaitu sebanyak 10 gr nutrien agar dilarutkan ke dalam 500 ml aquadest. Kemudian dipanaskan hingga mendidih. Larutan nutrien agar yang terdapat didalam erlenmeyer ditutup dengan kapas dan dibungkus dengan kertas serta diikat dengan karet. Larutan yang sudah ditutup disterilkan di dalam autoklav pada suhu 121 0C selama 20 menit. Kemudian larutan didinginkan hingga suhu 35 0C.
Untuk mengetahui jumlah bakteri yang tumbuh, dilakukan teknik pengenceran 108 dengan cara yaitu 8 buah tabung reaksi diisi masing-masing
sebanyak 9 ml aquadest steril lalu ditutup dengan kapas dan tabung reaksi sudah ditandai dengan angka 1-8. Sebanyak 1 ml kultur stok yang sudah dibiakkan selama 2 hari dimasukkan kedalam tabung reaksi no 1, dan dilakukan pengadukkan vorteks, lalu 1 ml diambil dari tabung reaksi no 1 dan dimasukkan kedalam tabung reaksi no 2 dan seterusnya hingga tabung no 8 berisi 1 ml dari tabung no 7.
Perhitunggan jumlah bakteri dikakukan pada pengenceran ke 6,7, dan 8 dengan cara yaitu sebanyak 1 ml dari setiap pengenceran dimasukkan ke dalam cawan petri secara dupplo lalu setiap cawan diisi dengan nutrien agar yang sudah dingin sebanyak ½ dari tinggi cawan petri. Cawan petri yang sudah berisi dibiarkan selama 2 hari. Setelah 2 hari, setiap cawan petri dilihat jumlah bakteri yang ada dengan coloni counter sehingga diperoleh jumlah bakteri yang tumbuh pada media pertumbuhan [17].
3.4.10 Prosedur Fermentasi
1. Diambil gliserol sesuai variabel yang sudah ada dan dimasukkan ke fermentor
2. Kemudian ditambahkan bakteri Enterobacter aerogenes yang telah diremajakan.
3. Gliserol yang sudah bercampur bakteri Enterobacter aerogenes difermentasi selama selang waktu pada suhu 37 ℃ [21].
3.4.11 Analisa 1,3-Propanadiol dengan Kromatografi GC
Hasil fermentasi berupa 1,3 Propanadiol dianalisa dengan menggunakan Kromatografi Gas sehingga didapat kemurnian 1,3-Propanadiol yang terbentuk.
3.5 FLOWCHART PENELITIAN