2 TINJAUAN PUSTAKA
3.1 Isolasi, Seleksi, Karakterisasi dan Identifikasi FMA dan Rizobakteri 1 Bahan yang Digunakan
3.1.4 Prosedur Percobaan Analisis Kimia Media Tanam
Media tanam yang digunakan adalah tanah ultisol dan pasir dengan perbandingan 1 : 1 (v/v). Sebelum digunakan, media tanam disterilisasi dengan menggunakan bahan kimia Basamid G dan dianalisis sifat-sifat kimianya. Berdasarkan hasil analisis kimia media tanam diketahui bahwa pH H2O 4.5, pH KCl 3.9, kandungan C 0.92%, N 0.09%, rasio C/N 10, P2O5HCl 18 mg per 100g, K2O HCl 12 mg per 100g, P2O5Bray 2.7 ppm, K2O Morgan 63 ppm, Ca 3.05 cmol kg-1, Mg 0.62 cmol kg-1, K 0.12 cmol kg-1, Na 0.06 cmol kg-1, KTK 14.62, KB 26%, kandungan Al+ 2.36 cmol kg-1dan H+ 0.31 cmol kg-1.
Isolasi Fungi Mikoriza Arbuskular (FMA)
FMA diisolasi dengan menggunakan teknik ekstraksi spora (Gerdemann dan Nicolson 1963). Sebanyak 100 g tanah disaring dalam keadaan basah dengan menggunakan saringan bertingkat. Spora diambil dan dipisahkan di bawah mikroskop stereo dan dikumpulkan sesuai dengan karakteristik morfologinya.
Isolasi Rizobakteri
Bakteri yang tumbuh di sekitar perakaran tanaman padi, jagung dan sorgum manis diisolasi dengan menggunakan media TSA (Triptyc Soy Agar). Isolat-isolat yang diperoleh selanjutnya diuji efektivitasnya terhadap pertumbuhan dan kandungan klorofil daun sorgum manis.
Seleksi FMA dan Rizobakteri
Seleksi FMA dan rizobakteri dilakukan dengan menguji efektivitas tiap isolat terhadap pertumbuhan dan kandungan klorofil daun sorgum manis. Media tanam
yang digunakan adalah campuran tanah ultisol dan pasir dengan perbandingan 1:1 (v/v). Media tanam selanjutnya disterilisasi dengan cara mencampurkannya dengan bahan kimia Basamid-G (10 g per 100 kg media tanam) dan diinkubasi selama seminggu sebelum digunakan. Benih sorgum manis sebelum ditanam disterilisasi terlebih dahulu dengan cara direndam dalam HClO42% selama sepuluh detik, kemudian dibilas dengan akuades sebanyak tiga kali.
Untuk seleksi FMA, rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap satu faktor, yaitu jenis FMA (A) yang terdiri dari :
A0 = Tanpa inokulasi FMA (kontrol) A1 = FMA jenis 1
A2 = FMA jenis 2 Sampai dengan A40 = FMA jenis 40
Setiap perlakuan diulang 2 kali sehingga diperoleh 41 x 2 = 82 satuan penelitian
Untuk seleksi rizobakteri, rancangan penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap satu faktor, yaitu jenis rizobakteri (B) yang terdiri dari :
B0 = Tanpa inokulasi bakteri (kontrol) B1 = Rizobakteri jenis 1
B2 = Rizobakteri jenis 2 sampai dengan B134 = Rizobakteri jenis 134
Setiap perlakuan diulang 2 kali sehingga diperoleh 135 x 2 = 270 satuan penelitian. Pemeliharaan tanaman meliputi penyiraman yang dilakukan 2 kali dalam sehari, pagi dan sore. Setiap 2 minggu sekali diukur peubah tinggi tanaman dan kandungan klorofil daun sorgum manis selama masa percobaan 2 bulan. Setelah 2 bulan derajat kolonisasi mikoriza pada perakaran tanaman diamati di bawah mikroskop.
Penetapan Kemampuan Penambatan N2
Isolat-isolat rizobakteri yang dapat meningkatkan pertumbuhan dan kandungan klorofil sorgum manis selanjutnya diuji kemampuannya dalam menambat N2. Kemampuan penambatan N2ditentukan dengan mengukur aktivitas nitrogenase. Aktivitas nitrogenase secara tidak langsung diukur berdasarkan pengukuran pengurangan gas asetilen menjadi gas etilen atau ARA (Acetylene Reduction Assay) (Bergensen 1980). Pengukuran ARA cukup bisa mewakili aktivitas nitrogenase dibandingkan metode lain secara tidak langsung.
Sebelum dilakukan pengukuran konsentrasi gas etilen dalam sample, terlebih dahulu harus dibuat kurva standar dari gas etilen yang diketahui kadarnya. Kurva standar terdiri dari beberapa konsentrasi gas etilen. Standar gas yang digunakan biasanya lebih dari 4 tingkat konsentrasi agar ketepatannya dapat dipertanggungjawabkan. Untuk itu diperlukan pembuatan deret standar.
Cara pembuatan standar adalah sebagai berikut : tabung yang digunakan harus kedap udara. Botol diisi dengan udara sebanyak volume botol sebagai gas
penyeimbang. Standar dibuat dalam berbagai konsentrasi. Sebelum gas standar dimasukkan, botol dikosongkan terlebih dahulu sebanyak gas yang akan dimasukkan ke dalam botol.
Pengukuran produksi etilen pada sampel diukur dengan prosedur yang sama dengan pengukuran pada standar. Konsentrasi etilen dalam sampel diperoleh dengan cara ekstrapolasi terhadap kurva standar.
Penetapan Kemampuan Pelarutan Fosfat
Penetapan kemampuan pelarutan fosfat dilakukan dengan menggunakan teknik spektrofotometri (Dick dan Tabatabai 1977). Pembuatan reagen dilakukan dengan cara melarutkan 0.704 g asam askorbat dan 3.268 g asam trikloroasetat dalam 10 mL air dan menambahkan lagi air hingga volume 40 mL (reagen A), melarutkan 2.472 g amonium molibdat dalam 100 mL air dan menambahkan lagi air hingga volume 200 mL (reagen B), serta melarutkan 5.882 g natrium sitrat dalam 10 mL asam asetat glasial dan mengatur volume hingga 200 mL (reagen C).
Untuk menentukan fosfat terlarut dicampurkan 0.32 mL sampel dan buffer/air, 0.40 mL reagen A, 0.08 mL reagen B, dan 0.20 mL reagen C. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 850 nm setelah 30 menit inkubasi. Sebagai standar digunakan protein kombinasi dari asam-asam fosfat (sigma).
Penetapan Kemampuan Produksi Fitohormon
Untuk mengukur kemampuan produksi fitohormon IAA, tiap bakteri ditumbuhkan pada media pertumbuhan minimal (5 g glukosa, 0.025 g yeast extract, 0.204 g L-tryptophan) sebanyak 5 mL dalam tabung selama 72 jam pada suhu 20 °C dengan agitasi 120 rpm. Selanjutnya 1 mL suspensi bakteri dipindahkan ke dalam 1.5 mL tabung dan diendapkan pada 16.750 xg selama 10 menit. Sebanyak 90 µL supernatan ditambahkan ke dalam 60 µL reagen Salkowski (0.5 M FeCl3 dan 35% asam perklorat = 1:49) dan diinkubasi selama 30 menit dalam keadaan gelap. Absorbansi dari tiap sampel selanjutnya diukur dengan Spektrofotometer pada panjang gelombang 530 nm (Furnkranz et al. 2009). Sebagai standar digunakan IAA sintetik yang telah diketahui konsentrasinya.
Untuk mengukur kemampuan produksi fitohormon GA, tiap bakteri ditumbuhkan di dalam mediaJensen’s Brothselama 5 hari pada temperatur 28oC. Selanjutnya kultur bakteri diendapkan untuk memisahkan biomassanya. Filtrat yang dihasilkan dimasukkan ke dalam corong pisah ukuran 100 mL. Air ditambahkan hingga volume 10 mL. Keasaman atau pH larutan diatur antara 1 dan 2 dengan menggunakan HCl 0.1 M. Etil asetat sebanyak 20 mL ditambahkan dan dikocok selama 60 detik. Fasa air selanjutnya dipindahkan ke dalam corong pisah kedua dan prosedur ekstraksi diulang dengan penambahan etil asetat sebanyak 20 mL. Fasa air dipisahkan kembali dan fasa organik ditampung di corong pisah yang pertama. GA diekstraksi kembali dari etil asetat dengan menambahkan 20, 15 dan 10 mL buffer fosfat (pH 7.4), selanjutnya dikocok selama 60 detik dan setiap ekstrak dikumpulkan dalam labu ukur 50 mL. Volume labu dipenuhi dengan menambahkan buffer fosfat (Berrí’oset al.2004).
Untuk menentukan konsentrasi GA, sebelumnya dibuat kurva standar. GA sintetik ditimbang sebanyak 200 mg dan dilarutkan dengan 10 mL etanol absolut, selanjutnya ditambahkan dengan air destilasi hingga 100 mL. Konsentrasi standar adalah 2 g L-1yang kemudian diencerkan dengan menambahkan larutan etanol 10% agar menjadi beberapa konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0.01 g L-1, 0.025 g L-1, 0.05 g L-1, 0.75 g L-1, 0.125 g L-1, 0.15 g L-1 dan 0.1 g L-1. Dengan perbandingan volume 1:1 pada masing-masing konsentrasi standar ditambahkan HCl 3.75 M. Larutan standar ini selanjutnya diinkubasi selama 75 menit. Setelah inkubasi, masing-masing larutan standar diukur absorbansinya dengan menggunakan Spectrophotometer UV-VISpada panjang gelombang 254 nm.
Pengukuran kemampuan produksi sitokinin dari tiap bakteri dimulai dengan ekstraksi menggunakan metode Hussain & Hasnain (2009). Kultur rizobakteri sebanyak 20 mL diendapkan dengan kecepatan 10000 xg selama 10 menit. Supernatan dinetralkan pH-nya dengan penambahan NaOH 0.1 N (jika terlalu asam) atau HCl 0.1 N (jika terlalu basa). Supernatan yang telah dinetralkan ditambah 5 mL etil asetat dan dibuat homogen dengan menggunakanvortexselama 1 menit. Ekstrak dibiarkan beberapa saat sampai fase air terpisah dari fase etil asetat, selanjutnya fase etil asetat dipisahkan. Pemberian etil asetat dilakukan sebanyak tiga kali secara bertahap, sehingga diperoleh 15 mL fase etil asetat yang siap untuk dievaporasi. Sitokinin yang terlarut dalam etil asetat akan menempel pada dinding tabung kemudian dilarutkan dengan 100μ L metanol.
Sitokinin yang dihasilkan dideteksi dengan TLC (Patelet al. 2012) dengan cara menotolkan fraksi metanol pada pelat TLC silika G60 F254dengan pembanding sitokinin sintetik (6-Benzylaminopurine). Pelat dielusi dengan menggunakan larutan kloroform : metanol (80 : 20 v/v). Hasil elusi dikeringkan dan diperiksa menggunakan sinarultraviolet pada panjang gelombang 254 nm. Deteksi sitokinin secara kualitatif dilakukan dengan cara membandingkan nilairetention factor(Rf) sampel dengan nilai Rf standar. Hasil deteksi selanjutnya dikonfirmasi menggunakan HPLC.
Pengukuran konsentrasi sitokinin dilakukan dengan menggunakan HPLC (Patel et al. 2012). Sampel diinjeksikan sebanyak 20 μ L ke dalam kolom fase terbalik (Dicovery C18, 5 µm, dimensi kolom 25 cm x 3.0 mm). Sampel dianalisis dengan menggunakan fase gerak 40% metanol. Detektor UV ditetapkan pada panjang gelombang 270 nm. Total waktu untuk pemisahan adalah sekitar 15 menit pada laju aliran 1 mL min-1.
Penetapan Derajat Kolonisasi Mikoriza
Derajat kolonisasi mikoriza dihitung dengan menggunakan metode gridline intersection(Giovannetti dan Mosse 1980). Sebanyak 2 g akar segar dibersihkan dan direndam dalam larutan KOH 10% dan dibiarkan semalam. Akar selanjutnya dibilas beberapa kali dengan akuades hingga bersih dari larutan KOH, direndam dalam larutan HCl 2% selama 30 menit dan dilakukan pewarnaan dengan menambahkantryphan blue 0.05% dalam larutan asam laktogliserol secukupnya (1:1:1 masing-masing untuk asam laktat, gliserol dan air) hingga akar terendam.
Sebelum akar diamati, dilakukan penghilangan warna dengan larutan gliserin 50%. Infeksi akar diamati dengan bantuan kotak bergaris (gridline intersect) yang dilekatkan pada dasar cawan petri. Derajat kolonisasi mikoriza adalah jumlah akar yang terinfeksi, yang dilihat dari banyaknya garis perpotongan pada penunjuk kotak bergaris dibandingkan dengan seluruh akar yang diamati.
Penetapan Kandungan Klorofil
Pada pengukuran kandungan klorofil daun, daun yang diukur adalah daun ketiga yang dihitung dari pucuk. Sebelum dilakukan pengukuran, daun terlebih dahulu dibesihkan dengan kertas tisu yang telah dibasahi akuades. Pengukuran kandungan klorofil daun dilakukan dengan menggunakan Chlorophyll Content Meter CCM-200, dimana penghitungan indeks kandungan klorofil (CCI) berdasarkan pada rasio transmitan pada panjang gelombang 660 dan 940 nm (Ghasemiet al.2011).
Identifikasi Isolat FMA
Isolat fungi mikoriza arbuskular diidentifikasi secara morfologi dengan metode yang dikembangkan oleh Schenck dan Perez (1990) dalam buku "Manual for the Identification of VA Mycorrhizal Fungi". Berdasarkan buku Manual tersebut, terdapat 9 tahapan dalam identifikasi fungi mikoriza arbuskular (FMA), yaitu ekstraksi spora dari tanah atau medium, pengamatan spora dalam air menggunakandissecting microscope(perbesaran 20-100x), pembuatan preparat (2- sided diagnostic slide), pengamatan spora pada preparat menggunakancompound microscope(perbesaran 100–1000x), pencatatan pada lembaran pengamatan dan pengukuran spora pada preparat, penentuan genus, penentuan spesies dan penentuan spesies yang terdekat dengan cara membandingkan dengan species description.
Identifikasi Isolat Rizobakteri
Teknik yang akurat untuk identifikasi molekuler bakteri adalah identifikasi terhadap gen penyandi 16S rRNA. Identifikasi didasarkan pada tingkat kesamaan dalam sekuens gen 16S rRNA. Teknik ini pertama kali dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983.
Pertama-tama dilakukan ekstraksi genom DNA. Larutan yang dibutuhkan adalah : Buffer lisis 10x (Tris 0.5M pH 8.5; EDTA 0.01M; 5% Tween 20; ddH2O) dan Proteinase K 20 mg mL-1. Isolat bakteri ditumbuhkan pada media padat dan diinkubasi selama 1 malam.Tabung berukuran 1.5 mL disiapkan untuk campuran 20 µL buffer lisis 10x, 10 µL Proteinase K dan 170 µL ddH2O. Biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung dengan menggunakan tusuk gigi steril dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 50-55oC. Selanjutnya enzim dinonaktifkan pada suhu 95- 100oC selama 10 menit dan diendapkan selama 3 menit pada kecepatan 13.000 xg. Hasil lisis siap untuk digunakan sebagai cetakan.
DNA target yang telah diisolasi selanjutnya diamplifikasi dengan PCR menggunakan enzim DNA polimerase untuk memproduksi dua kali lipat dalam
setiap siklus suhu. Primer yang digunakan adalah : Universal reverse primer (UniB1) 5'-GGTTAC(G/C)TTGTTACGACTT-3' danEubacterial forward primer (BacF1) 5'-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3'. Sebagai substrat adalah dNTP (larutan stok 20 mM, larutan kerja 10 mM). Enzim yang digunakan adalah Taq DNA polimerase. Master mix dibuat dengan melebihkan 1 reaksi dari jumlah sampel yang akan di PCR. Pembuatan master mix dilakukan dengan mencampurkan buffer PCR 10x, BacF1 5 µM, UniB1 5 µM, dNTP 10mM, ddH2O dan Taq DNA polimerase 50 µL. Campuran dikocok dan master mix dibagi ke dalam tabung PCR masing-masing 40 µL, selanjutnya ditambahkan 1-10 µL DNA cetakan dan ditambahkan ddH2O hingga volume menjadi 50 µL. Tabung diputar agar semua larutan turun dan ditempatkan dalam mesin PCR. Denaturasi awal 94 oC selama 2 menit, denaturasi pada siklus amplifikasi 94 oC selama 1 menit, anealing48oC selama 1 menit, elongasi 72oC selama 1 menit dan elongasi lanjutan 72oC selama 10 menit.
Segmen yang telah diamplifikasi selanjutnya diamati dengan elektroforesis gel agarose. Larutan yang harus disiapkan adalah larutan stok TBE 10x steril, ddH2O steril, EtBr (Etidium Bromida),loading buffer dan agarose. Pertama-tama 0.4 g agarose ditimbang dan dilarutkan dalam 40 mL TBE 1x untuk mendapatkan gel agarose 1%. Larutan agarose dipanaskan hingga mendidih dan dibiarkan hingga suhu sekitar 60oC, selanjutnya ditambahkan 3 µL larutan EtBr. Larutan agarose dituangkan ke dalam rak elektroforesis yang telah disiapkan dan dibiarkan hingga dingin. Setelah dingin, penutup rak dan sisirnya dibuka dan ditempatkan pada chamber elektroforesis yang sudah berisi buffer TBE 1x. Larutan hasil PCR dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis, begitu pula dengan marker sebagai penanda jarak. Elektroforesis dilakukan pada voltase 85 V selama 45 menit dan hasil elektroforesis diamati di bawah sinar UV.
Pemurnian DNA hasil PCR dari gel dilakukan menggunakan GFX Purification Kit. Tabung 1.5 mL yang kosong ditimbang. Agarose yang mengandung fragmen DNA dipotong di bawah sinar UV menggunakan pisau steril dan dimasukkan ke dalam tabung yang sudah ditimbang. Selanjutnya tabung berisi gel ditimbang dan selisihnya dihitung. 10 µL buffer ditambahkan ke dalam setiap 10 mg bobot gel. Tabung ditutup dan diputar hingga isinya tercampur, diinkubasi pada 60oC hingga semua agarose larut (5-15 menit). Selama inkubasi, satu kolom GFX ditempatkan pada tabung penampung. Setelah agarose larut semuanya, diputar sebentar untuk mengumpulkan larutan pada dasar tabung. Sampel dipindahkan ke kolom GFX dan diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruang, selanjutnya diendapkan pada kecepatan maksimal selama 30 detik. Larutan pada tabung penampung dibuang dan kolom GFX ditempatkan kembali ke dalam tabung penampung. Ke dalam kolom ditambahkan 500 µL buffer dan diendapkan selama 30 detik pada kecepatan maksimal. Larutan pada tabung dibuang dan kolom GFX dipindahkan ke dalam tabung baru berukuran 1.5 mL. DNA dielusi dengan 50 µL ddH2O atau buffer elusi, diinkubasi pada 37 oC selama 3 menit, kemudian diendapkan pada kecepatan maksimum selama 1 menit. Konsentrasi hasil GFX diperiksa dengan elektroforesis gel agarose. Konsentrasi DNA hasil GFX dihitung
dengan membandingkannya dengan konsentrasi DNAmarkeryang sudah diketahui melalui elektroforesis gel agarose. Selanjutnya dilakukan sekuensing.
Tahap pertama sekuensing serupa dengan teknik PCR yang memerlukan suhu berulang. Primer yang biasa digunakan untuk 16S rRNA diantaranya adalah 357F (5'TACGGGAGGCAGCAG3'). Ke dalam tabung 200 µL dimasukkan 200 ng sampel DNA, 2.4 pmol primer dan akuades steril sehingga volume total 9 µL. Campuran dalam tabung dicampur hingga merata. Tabung selanjutnya dimasukkan ke dalam mesin PCR dan dilakukan denaturasi awal. Denaturasi dilakukan pada suhu 96 oC selama 30 detik, anealing 48oC selama 15 detik dan elongasi 60 oC selama 4 menit. Setelah denaturasi awal, program dihentikan dan dimasukkan 6 µL campuran Dye Terminator Cycle Sequencing kit dengan AmpliTaq DNA Polimeraseke dalam masing-masing tabung. Proses reaksi sekuensing dilanjutkan sampai selesai.
DNA hasil reaksi sekuensing selanjutnya dimurnikan dengan menggunakan Sephadex G-50. Sebanyak 600 µL larutan Sephadex G-50 (2.5 g per 45 mL TE) dimasukkan ke dalam kolom pemurnian steril dan fraksi diendapkan pada 5500 xg selama 1 menit. Penampung diganti dengan tabung 1.5 mL yang baru. Semua isi tabung dimasukkan menggunakan pipet ke permukaan kolom Sephadex G-50 dan fraksi diendapkan pada 5500 xg selama 1 menit. Hasil pemurnian dikeringkan pada suhu 45 oC (kira-kira 45 menit). Sebanyak 4.5 µL loading bufferditambahkan ke dalam tiap tabung yang berisi hasil pemurnian, selanjutnya dicampur dan disimpan dalam es. Selanjutnya dilakukan denaturasi dalamwater bath92oC selama 2 menit dan disimpan dalam es. Sebanyak 4 µL sampel dimasukkan ke dalam sumur gel akrilamida dan siap disekuensing.
Sekuen yang diperoleh dibandingkan dengan database yang tersedia dalam NCBI menggunakan Blast search engine http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Pohon filogenik dibuat menggunakan program ClustalW (Mega 3.1) dengan membandingkan beberapa DNA sekuen dari spesies bakteri yang diperoleh dari database gen di NCBI.
Pengujian Patogenisitas Rizobakteri
Rizobakteri yang telah terseleksi selanjutnya diuji patogenisitasnya untuk memastikan bahwa mikrob tersebut aman bagi manusia, hewan maupun terhadap tanaman. Pengujian patogenisitas terhadap manusia dan hewan dilakukan secara in vitro dengan menggunakan mediaBlood Agar(Suardana 2014). Biakan rizobakteri ditanam pada media Blood Agar dan diinkubasi selama 18 hingga 24 jam. Sementara itu, pengujian patogenisitas isolat bakteri terhadap tanaman dilakukan terhadap tanaman tembakau (Arwiyanto 2007). Biakan bakteri dilarutkan dalam air steril, dimasukan ke dalam jarum suntik sebanyak kurang lebih 2 ml. Biakan tersebut disuntikkan pada daun tembakau diantara tulang-tulang daun. Diamati mulai jam ke-3 setelah perlakuan. Perubahan pada permukaan daun diamati secara organoleptik. Bila terdapat gelaja nekrosis pada daun menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut patogen terhadap tanaman.
3.2 Peranan FMA dan Rizobakteri dalam Meningkatkan Proses Fotosintesis,