METODOLOGI PENELITIAN
3.7 Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data .1 Prosedur Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Delima.1Prosedur Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Delima
Bahan baku berupa buah delima sebanyak 5000 gram dibersihkan, dikeluarkan bijinya sehingga yang tersisa kulit buah delima (Gambar 3). Selanjutnya kulit buah delima diiris halus dan diperoleh bahan baku kulit buah delima seberat 2170 gram (Gambar 4). Kemudian dikeringkan di lemari pengering selama 10 hari (Gambar 5).
Kulit buah delima yang telah kering kemudian ditimbang kembali dan didapatkan berat 630 gram kemudian diambil sebanyak 250 gram untuk diblender sampai menjadi serbuk simplisia (Gambar 6). Kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 1 jam dengan pelarut etanol 70% (Gambar 7a). Simplisia tersebut diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Setelah 1 jam, massa dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dengan hati-hati sambil sesekali ditekan dengan menggunakan sendok. Pada bagian ujung alat perkolator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring (Gambar 7b). Kemudian dituangkan etanol 70% sebanyak 300 ml dan biarkan sampai cairan menetes untuk mengetahui apakah perkolator sudah berfungsi dengan baik.
23
perkolator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetes/menit. Sampel pada tabung perkulator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan jernih. Semua perkolat digabung dan disaring, lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan < 1 ATM dengan temperatur ≤ 55°C (Gambar 8a). Prosedur berikutnya dilakukan waterbath untuk memperoleh hasil akhir berupa ekstrak kental kulit buah delima yang kemudian disimpan di dalam wadah tertutup dan diletakkan di lemari pendingin. (Gambar 8b).
Gambar 3. Buah delima yang telah dicuci bersih
Gambar 4. a)Pemisahan kulit delima dengan biji serta pengirisan kulit buah delima;b) Kulit buah delima yang telah diiris tipis
24
Gambar 5. a)Pengeringan kulit buah delima di dalam lemari pengering; b)Kulit buah delima yang telah kering
Gambar 6. a)Penghalusan kulit buah delima yang telah kering dengan blen- der; b) Simplisia kulit buah delima
Gambar 7. a) Simplisia dimaserasi dalam etanol 70% selama 1 jam; b) Proses perkolasi kulit buah delima
25
Gambar 8.a) Penguapan perkolat dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator;b)Ekstrak kental kulit buah delima 3.7.2 Pengenceran Bahan Coba
Ekstrak kulit delima ditimbang dengan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Tryptic Soy Broth (TSB). Disediakan 6 buah tabung, pada tabung pertama diisi 1,25 gram ekstrak kental kulit buah delima dan dilarutkan dengan 5 ml TSB, kemudian dicampur dengan menggunakan vorteks sehingga diperoleh ekstrak kulit buah delima dengan konsentrasi 25%. Lima buah tabung lainnya kemudian diisi masing-masing l ml TSB. Selanjutnya dilakukan pengenceran dengan cara mengambil ½ dari esktrak kulit buah delima konsentrasi 25% menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ekstrak kulit buah delima 12,5% (pengenceran ganda). Demikian seterusnya sampai tabung ke-6 sehingga dihasilkan konsentrasi 6,25%, 3,125%, 1,6125% dan 0,8%. Tabung-tabung tersebut kemudian diberi label sesuai konsentrasinya.
3.7.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media bakteri dengan melarutkan bubuk Tryptic Soy Agar (TSA) sebanyak 20 gram ke dalam 500 ml akuades untuk 40 petri (20 ml/petri) (Gambar 9), kemudian dimasukkan ke dalam autoclave selama 15-20 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu 121°C (Gambar 10). Selanjutnya,
26
media disimpan di dalam lemari pendingin (Gambar 11). Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali sehingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
Gambar 9. Penimbangan TSA dengan electronic balance dan pelarutan dengan akuades
27
3.7.4 Pembuatan Suspensi Bakteri
Kegiatan pembuatan suspensi bakteri menggunakan Aa yang telah dibiakkan secara murni pada media Tryptic Soy Agar (TSA) dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCL 0,9% sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 108 CFU/ml.
3.7.5 Pembuatan Kontrol Positif
Kontrol positif yang digunakan adalah suspensi bakteri yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya. Suspensi bakteri tersebut diambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam microplate.
3.7.6 Pembuatan Kontrol Negatif
Kontrol negatif yang digunakan adalah ekstrak kulit buah delima tanpa suspensi bakteri. Ekstrak ini diambil sebanyak 2 ml dengan menggunakan mikropipet dan dimasukkan ke dalam microplate.
3.7.7 Penentuan KHM Bahan Coba
Bahan coba ekstrak buah delima yang dipakai terdiri dari konsentrasi 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,6125% dan 0,8%. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam microplate kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya ambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing microplate bahan coba yang telah diberi label kemudian dihomogenkan. Microplate tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO2 dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba (Gambar 12). Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau
28
bahan uji apapun yang menghambat pertumbuhan Aa dalam media perbenihan setelah diinkubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni bakteri dalam perbenihan tersebut.
Gambar 12. Media perbenihan setelah diinkubasi
3.7.8 Penentuan KBM bahan coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan perhitungan jumlah koloni bakteri yaitu pada konsentrasi25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,6125% dan 0,8% dengan metode Drop Plate Miles Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing dihomogenkan dan diambil 50 �l untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat Tryptic Soy Agar (TSA) dan
direplikasi 4 petri, diamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37°C selama 24 jam (Gambar 13;Gambar 14). Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan menggunakan kaca pembesar dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU (Colony Forming Unit)/ml cairan(suspensi)
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah reratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena itu, konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor
29
pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 �l, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar (CFU/ml).
Gambar 13. Cawan petri dengan berbagai konsen trasi yang telah diteteskan dengan suspensi bakteri dan ekstrak kulit buah delima
