METODOLOGI PENELITIAN
2 KBM (Kadar
3.7 Proses Pengambilan dan Pengumpulan Data .1Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis .1Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis
Buah manggis diperoleh dengan cara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan sumber lain. Buah manggis diperoleh dari Pasar Buah Brastagi, Medan, Sumatera Utara dimana asal tumbuh Sibolangit dengan berat 1000 gram. Buah
manggis dikeluarkan dan dibersihkan dari kotoran sehingga yang tersisa kulit buah manggis. Bahan baku berupa kulit buah manggis sebanyak 895 gram dibersihkan dari kotoran, dicuci bersih, lalu dipotong kira-kira setebal 0,3 mm dan dikeringkan di lemari pengering.
Gambar 6. Buah manggis dikeluarkan dan dibersihkan dari kotoran
Gambar 7. Kulit buah manggis diiris tipis
Gambar 8. Kulit buah manggis yang telah diiris tipis dimasukkan ke lemari pengering
Sampel yang telah kering kemudian diblender sampai menjadi serbuk simplisia dan diambil sebanyak 300 g yang diperkirakan cukup untuk membuat ekstrak kulit manggis pada pengujian efektivitas antibakteri. Serbuk simplisia kemudian dimasukkan ke dalam wadah dan dimaserasi selama 3 jam dengan pelarut etanol 70%. Diaduk sesekali dengan keadaan etanol cukup merendam sampel. Setelah 3 jam, simplisia diperkolasi dengan menggunakan perkolator yang ditutup dengan aluminium foil dan dibiarkan selama 24 jam. Pada bagian ujung alat perkolator disumbat dengan kapas basah dan dilapisi kertas saring.
Gambar 9. Kulit buah manggis yang sudah kering dihaluskan
Gambar 10. Simplisia dimaserasi dalam etanol 70% selama 3 jam
Setelah 24 jam, bagian ujung perkolator yang juga disambungkan pada tabung untuk menampung cairan dapat dibuka dengan kecepatan tetesan ±20 tetes/menit. Sampel pada tabung perkolator tetap dijaga dalam kondisi terendam etanol selama dilakukan penampungan perkolat. Prosedur penampungan perkolat dilakukan sampai perkolat yang dihasilkan berwarna jernih.
Gambar 11. Penampungan perkolat
Semua perkolat digabung lalu diuapkan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator pada tekanan <1 ATM dengan temperatur ≤ 50°C. Prosedur berikutnya dilakukan waterbath untuk memperoleh hasil akhir berupa ekstrak kental kulit buah manggis.
Gambar 12. Penguapan perkolat dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator
Gambar 13. Ekstrak kental kulit buah manggis
3.7.2 Pengenceran Bahan Coba
Ekstrak kulit manggis ditimbang dengan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth (MHB). Disediakan 7 buah tabung, pada masing-masing tabung diisi 1 ml MHB. Pada tabung pertama diisi 1 gram ekstrak kental kulit manggis kemudian dicampur dengan menggunakan vorteks sehingga diperoleh ekstrak kulit buah manggis dengan konsentrasi 100%. Kemudian dilakukan pengenceran dengan cara mengambil ½ dari ekstrak kulit buah manggis konsentrasi 100% menggunakan mikropipet dan diletakkan pada tabung ke-2 untuk mendapatkan ekstrak kulit buah manggis 50% (pengenceran ganda). Demikian seterusnya sampai tabung-7 sehingga dihasilkan konsentrasi 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, dan 1,5625%. Tabung-tabung tersebut kemudian diberi label sesuai konsentrasinya.
3.7.3 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, dibuat media MHA sebanyak 12 gram dilarutkan ke dalam 240 ml aquadest untuk 40 petri (20 ml/petri), lalu dipanaskan di atas tungku pemanas magnetik sampai mendidih. Kemudian media yang telah masak, disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan udara 2 ATM, suhu
121°C. Setelah disterilkan, media disimpan di dalam lemari pendingin. Jika akan digunakan kembali, media dipanaskan kembali hingga mendidih, lalu dituangkan ke dalam masing-masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
3.7.4 Pembiakan Spesimen
Kegiatan pembiakan spesimen dilakukan dalam suasana anaerob pada inkubator CO2. Fusobacterium nucleatum yang digunakan adalah specimen stem cell
Fusobacterium nucleatum ATCC 25586 yang telah dibiakkan secara murni pada
media MHA yang telah disiapkan pada prosedur sebelumnya dalam suasana anaerob. Sebanyak 1-2 ose dari biakan murni bakteri uji yang telah dikultur dan tumbuh dengan subur disuspensikan dengan menggunakan larutan NaCl 0,9% sampai diperoleh kekeruhan sesuai standar 0,5 Mac Farland atau sebanding dengan jumlah bakteri 1 x 108 CFU/ml.
3.7.5 Penentuan KHM bahan coba
Bahan coba ekstrak kulit buah manggis yang dipakai terdiri dari konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% dan 1,5625%. Dari masing-masing konsentrasi tersebut diambil sebanyak 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian diberi label sesuai konsentrasinya. Selanjutnya diambil 1 ml suspensi bakteri yang telah dipersiapkan sebelumnya dengan menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam masing-masing tabung bahan coba yang telah diberi label kemudian divorteks. Lalu tabung-tabung tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam pada inkubator CO2 dan diamati kekeruhan yang terjadi dengan bantuan spektrofotometer dan membandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM dari masing-masing bahan coba. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan KHM yaitu konsentrasi minimal ekstrak atau bahan uji apapun yang mampu menghambat
pertumbuhan Fusobacterium nucleatum dalam media perbenihan setelah diikubasi 24 jam dan tidak tumbuh koloni kuman dalam perbenihan tersebut.
3.7.6 Penentuan KBM bahan coba
Hasil prosedur penentuan nilai KHM tidak terlihat larutan yang mulai tampak jernih sehingga semua kelompok larutan dilanjutkan dengan penghitungan jumlah koloni bakteri, yaitu pada konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125% dan 1,5625% dengan metode Drop Plate Mills Mesra. Setelah itu, bahan coba dengan konsentrasi tersebut masing-masing divorteks dan diambil 50 μl untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam media padat (Mueller Hinton Agar), direplikasi sebanyak 5 petri, didiamkan selama 15-20 menit sampai mengering dan diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 370C selama 24 jam dan media padat akan tumbuh menjadi 1 koloni bakteri. Dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri untuk mendapatkan nilai KBM dengan bantuan kaca pembesar. Perhitungannya adalah bila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari 1 koloni, bila bentuknya 2 koloni bersinggungan dianggap sebagai 2 koloni. Satuan yang dipakai adalah CFU (Colony Forming Unit) / ml cairan (suspensi).
Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, kemudian dibuat jumlah rata-ratanya dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x 1, selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 μl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil sesuai satuan standar (CFU/ml).
