METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
3.3 Rancangan Penelitian (OECD, 2008) .1 Besar Sample .1 Besar Sample
Penelitian ini bersifat eksperimental dengan metode Up and Down dan terdiri dari 2 kelompok perlakuan, yaitu kelompok kontrol dan kelompok uji. Pemilihan hewan uji dilakukan secara random. Masing-masing kelompok uji gelatin babi golongan farmasetik dan pro analisis terdiri dari 3 ekor tikus putih betina galur Sprague Dawley. Penelitian ini telah lolos kaji etik oleh Komite Etik Penelitian Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (Lampiran 2).
3.3.2 Dosis Perlakuan
Metode Up and Down yang digunakan pada penelitian ini adalah limit test
dengan dosis perlakuan adalah 5000 mg/kgBB tikus. Pemberian dosis dilakukan secara bertahap. Penentuan dosis 5000 mg/kgBB pada limit test disebabkan data persyaratan nilai LD50 untuk gelatin adalah 5000 mg/kgBB (Rowe, Sheskey dan Quinn, 2009). Perhitungan dosis dapat dilihat pada lampiran 5. Dosis diberikan dalam bentuk tunggal secara oral. Bahan pembawa yang digunakan untuk melarutkan gelatin babi adalah akuades.
Tabel 3.1. Dosis Perlakuan Pada Tikus
Tikus Perlakuan Dosis
1.
Kontrol (akuades) 2.
3.
Gelatin Babi Golongan Farmasetik
5000 mg/kgbb
4. 5000 mg/kgbb
5. 5000 mg/kgbb
6.
Gelatin Babi Golongan Pro Analisis 5000 mg/kgbb
7. 5000 mg/kgbb
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 3.4 Prosedur Kerja
3.4.1 Penyiapan Bahan Uji (Rowe, Sheskey dan Quinn, 2009)
Masing-masing gelatin babi golongan farmasetik dan pro analisis ditimbang sebanyak ±800 mg. Selanjutnya, masing-masing gelatin babi golongan farmasetik dan pro analisis didispersikan dalam 4 ml akuades pada suhu 60oC sambil diaduk. Kemudian larutan dispersi gelatin babi didiamkan pada suhu 250C hingga suhunya turun menjadi 30oC dan diberikan ke tikus secara oral.
3.4.2 Penyiapan Hewan Uji (OECD, 2008)
Tikus betina galur Sprague-Dawley diaklimatisasi di Animal House Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan selama 10 hari. Animal house berada dalam kondisi terang selama 12 jam dan berada dalam kondisi gelap selama 12 jam. Tikus dipelihara pada kandang dengan suhu 220C (±30C) dan diberikan makan dan minum ad libitum. Masing-masing tikus uji ditempatkan dalam kandang yang berbeda (1 kandang berisi 1 tikus).
3.4.3 Uji Toksisitas Akut Gelatin Babi dengan Metode Up and Down (OECD 425, 2008)
Metode uji toksisitas akut yang digunakan pada penelitian ini adalah limit test
dari Up and Down Procedure (UDP). Larutan diberikan dalam dosis tunggal secara oral dengan menggunakan sonde lambung.
Pada limit test digunakan 2 ekor tikus sebagai kontrol dan 3 ekor tikus pada masing-masing kelompok uji. Sebelum perlakuan, tikus tidak diberi makan (dipuasakan) selama 12 jam kemudian ditimbang. Setelah ditimbang, tikus kontrol diberikan akuades dengan volume administrasi 4 ml secara oral. Pada masing-masing kelompok uji, tikus diberikan gelatin babi golongan farmasetik dan pro analisis dengan dosis 5000 mg/kgbb. Setelah perlakuan, tikus dipuasakan selama 4 jam dan diamati adanya tanda toksisitas.
Pengamatan jangka pendek dilakukan setiap 30 menit selama 4 jam awal setelah pemberian bahan uji. Pengamatan jangka panjang dilakukan setiap harinya selama 14 hari. Jika setelah 48 jam pemberian bahan uji tidak ada kematian pada tikus,
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta maka masing-masing larutan gelatin babi golongan farmasetik dan pro analisis diberikan pada 2 ekor tikus lainnya dengan dosis yang sama. Limit test dapat terdiri dari 3 termin. Jika hasil uji pada dua termin awal limit test tidak menunjukkan adanya kematian pada hewan uji, maka limit test dapat dihentikan (lampiran 6). Sedangkan jika terdapat tikus yang mati pada kedua termin awal, maka pengujian harus dilanjutkan ke limit test termin ketiga. Jika hasil dari ketiga termin limit test menunjukkan adanya kematian pada 3 ekor tikus atau lebih, maka uji dilanjutkan ke main test.
3.4.4 Pengamatan Toksisitas
3.4.4.1 Penentuan Nilai LD50 (OECD,2008)
Penentuan nilai LD50 gelatin babi golongan farmasetik dan pro analisis dilakukan dengan menggunakan software AOT425StatPgm. Data yang didapatkan dari uji toksisitas, yakni respon hewan uji (hidup atau mati) terhadap dosis perlakuan dimasukkan ke dalam software sehingga software akan mengkalkulasikan nilai LD50.
Respon hewan uji yang bertahan hidup dilambangkan dengan “O” dan respon hewan uji yang mengalami kematian dilambangkan dengan “X”. Selain untuk menentukan
nilai LD50, software ini juga berfungsi untuk penentuan dosis uji berikutnya dan waktu penghentian uji toksisitas.
3.4.4.2 Pengamatan Berat Badan Tikus (Jothy, et al., 2011)
Sebelum memulai perlakuan, masing-masing tikus kontrol dan uji ditimbang berat badannya. Setelah perlakuan, berat badan tikus ditimbang setiap hari selama 14 hari untuk melihat adanya kemungkinan perubahan secara bermakna pada berat badan tikus.
3.4.4.3 Pengamatan Tanda Toksisitas
Tanda toksisitas diamati secara visual setelah pemberian gelatin babi golongan farmasetik dan pro analisis. Pengamatan dilakukan setiap 30 menit selama 4 jam awal dan dilanjutkan setiap harinya hingga 14 hari (OECD, 2008). Tanda toksisitas diamati dengan cara membandingkan tingkah laku tikus uji dan tikus kontrol. Adapun tanda toksisitas yang diamati meliputi adanya piloereksi, konvulsi (kejang), tremor
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta (gemetar), respon daun telinga, perubahan pada mata, hiperaktivitas, hipersalivasi, lakrimasi dan mati (Sabbani, et al., 2015).
3.4.4.4 Pengamatan Histopatologi Organ Hati dan Ginjal Tikus
Pemeriksaan histopatologi organ hati dan ginjal dilakukan untuk mengamati pengaruh pemberian gelatin babi golongan farmasetik dan pro analisis terhadap organ hati dan ginjal tikus. Pemeriksaan histopatologi organ hati dan ginjal dilakukan pada seluruh tikus uji dan kontrol. Tikus yang masih bertahan hidup hingga hari ke 14, dimatikan dengan cara inhalasi menggunakan eter dan kemudian diambil organ hati dan ginjalnya. Selanjutnya organ hati dan ginjal dicuci dengan NaCl 0,9% dan difiksasi BNF 10%. Organ hati dan ginjal direndam dalam larutan BNF dan kemudian dibuat preparat histologinya.
Bentuk kerusakan yang diamati pada jaringan hati meliputi pelebaran asinus, degenerasi lemak dan nekrosis pada hepatosit. Derajat kerusakan hati dinilai dengan menggunakan sistem skoring (tabel 3.2). Pengamatan preparat dilakukan di bawah mikroskop optik dengan perbesaran 10x40 dan menggunakan 10 lapang pandang. Skoring dilakukan untuk masing-masing lapang pandang dan kemudian dijumlahkan (Andreas, 2015).
Tabel 3.2 Skoring Derajat Kerusakan Jaringan Hati
Skor Keterangan
0 Hepatosit tampak nomal
1 Terdapat pelebaran asinus, degenerasi lemak atau nekrosis terfokus di satu tempat
2 Terdapat pelebaran asinus, degenerasi lemak atau nekrosis terfokus di beberapa tempat
3 Terdapat pelebaran asinus, degenerasi lemak atau nekrosis terfokus di seluruh tempat
Sumber: Andreas, et al., 2015
Pada jaringan ginjal tikus, bentuk kerusakan yang diamati merupakan kerusakan pada glomerulus. Pengamatan dilakukan pada 30 glomerulus yang dipilih secara random untuk setiap preparat tikus. Preparat histopatologi ginjal diamati dengan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta mikroskop optik pada perbesaran 10x20. Bentuk kerusakan yang ada dinilai dengan sistem skoring (tabel 3.3).
Tabel 3.3 Skoring Derajat Kerusakan Jaringan Ginjal
Skor Keterangan
0 Struktur glomerulus normal
1 Terdapat dilatasi kapiler glomerulus
2 Terdapat atrofi glomerulus (glomerulus mengkerut) Sumber: Leehey, et al.,2008