Ameloblastoma merupakan tumor yang berlokasi di tulang, dan dapat terus berlanjut hingga menembus ke jaringan lunak. Untuk berkembang di dalam tulang ameloblastoma harus memiliki mekanisme resorpsi. Namun bagaimana mekanisme resorpsi itu terjadi hingga saat ini masih sangat kurang dipahami. Mekanisme ameloblastoma tumbuh membesar dan menginvasi terlihat pada ekspresi TNF-α, protein anti apoptotik (Bcl-2,Bcl-XL), dan protein interfase (faktor pertumbuhan fibroblas [ FGF], matriks metaloprotein [ MMP], ameloblastoma mengalami proliperasi terlihat dalam siklus sel yang berhubungan dalam Ki-67. Mutasi gen p 53 tidak terlihat pada perkembangan atau pertumbuhan amelolastoma.2
Penelitian Ferry Sandra dkk (2005) mekanisme RANKL dan TNF-α diekspresikan dalam sel-sel ameloblastoma, hal ini dibuktikan dengan adanya proses osteoklastogenesis dimana dapat menghasilkan ruangan pada tulang akibat dari ekspansi ameloblastoma itu sendiri.7 OPG secara bermakna menghambat ameloblastoma dalam osteoklastogenesis secara tidak langsung OPG dapat digunakan sebagai reseptor penghambat proses pertumbuhan ameloblastoma.28 Osteoklas multinuklear berasal dari prekursor hematopoietik dari sel line monosit / makrofag, dan sel stroma dalam sumsum tulang dan osteoblas memodulasi diferensiasi osteoklas melalui molekul yang disekresikan langsung dan melalui interaksi sel ke sel, dan Jalur sinyal melibatkan reseptor diaktifkan faktor nuklear ĸB (RANK) dan ligan (RANKL) memainkan peran utama dalam mengendalikan osteoklastogenesis.29 RANKL, diekspresikan pada membran plasma sel stroma dan osteoblastik mengikat RANK diekspresikan pada membrane plasma asal osteoklas untuk menginduksi jalur sinyal yang menyebabkan diferensiasi dan fusi dari sel prekursor osteoklas dan mempromosikan kelangsungan hidup dan aktivitas osteoklas dewasa. Osteoblas yang disekresikan sebagai penghambat RANKL disebut osteoprotegerin berfungsi menghalangi interaksi antara RANKL dan RANK sehingga menghalangi pembentukan osteoklas.30.
Universitas Indonesia 2.11. Imunohistokimia
Imunohistokimia merupakan proses dalam mendeteksi antigen pada sel dari jaringan dengan prinsip reaksi antibodi yang berikatan terhadap antigen pada jaringan. Imunohistokimia seringkali digunakan untuk mengukur dan mengidentifikasi karakteristik dari proses proliferasi sel, apoptosis sel. Imunohistokimia juga sering digunakan untuk penelitian dasar dalam rangka mengetahui distribusi dan lokasi biomarker ataupun protein terekspresi pada berbagai macam jaringan pada tubuh. Untuk memvisualisasikan hasil interaksi antara antigen dan antibodi dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, dimana cara yang paling sering digunakan ialah dengan konjugasi antibodi dengan enzim seperti peroksidase. 31
Antibodi poliklonal
Antibodi poliklonal diproduksi dengan imunisasi hewan yang cocok, biasanya mamalia. Antigen disuntikkan ke binatang, Ig G spesifik untuk antigen ini diproduksi oleh limfosit B sebagai respon imun, dan ini adalah imunoglobulin dimurnikan dari serum hewan. Antibodi diproduksi oleh metode ini berasal dari berbagai jenis sel kekebalan tubuh, dan karenanya disebut poliklonal. 32
Antibodi monoklonal
Antibodi monoklonal berasal dari garis sel tunggal (juga disebut sebagai klon). Dalam teknologi antibodi monoklonal, sel tumor yang dapat mereplikasi tanpa henti menyatu dengan sel mamalia yang menghasilkan antibodi. Hasil fusi sel disebut "hibridoma", yang akan terus memproduksi antibodi. Antibodi monoklonal adalah identik karena diproduksi oleh sel imun yang semuanya adalah klon dari sel induk tunggal. Produksi antibodi monoklonal memerlukan imunisasi hewan, biasanya tikus, mendapatkan sel-sel imun dari limpa. 32
Metode imunohistokimia, dapat dilakukan dengan metode Direct / langsung maupun Metode Indirect / tidak langsung. Dimana keduanya ditentukan oleh prinsip reaksi antibodi yang digunakan, yakni:
Metode Direct / langsung
Metode imunohistokimia direct menggunakan antibodi primer yang sudah terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target secara langsung.
Metode Indirect / tidak langsung
Metode imunohistokimia indirect menggunakan antibodi primer yang tidak ada labelnya, namun digunakan juga antibodi sekunder yang sudah memiliki label dan akan bereaksi dengan IgG dari antibodi primer. 32
2.11.1. Imunohistokimia Metode Da Silva
Untuk imunohistokimia , jaringan potong di 3 µM dan dikumpulkan dalam serial di slide kaca dilapisi dengan 2% 3-aminopropyltriethylsilane (Sigma Kimia, St Louis, MO) yang deparafinasi dan dehidrasi. Bagian itu kemudian diinkubasi dengan hidrogen peroksida 3% dan direndam dalam bufer sitrat, pH 6,0, selama 20 menit pada 95 ° C Bagian itu kemudian diblokir oleh inkubasi dengan serum kambing 3% normal pada suhu kamar, selama 20 menit, dan slide diinkubasi dengan antibodi poliklonal kelinci anti-OPG (H-249, sc11383, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA ) diencerkan 1:200, anti-RANK (H-300, sc9072, Santa Cruz Bioteknologi) diencerkan 1:200,dan anti-RANKL (FL-327, sc9073, Santa Cruz Bioteknologi) diencerkan 1:150; pada 4 ° C, semalam , dalam ruang lembab. Setelah mencuci di TBS (tris-buffered saline), bagian diobati dengan streptavidin-biotin berlabel kit (K0492, Dako, Carpinteria, CA). Bagian tersebut kemudian diinkubasi dalam 3,3 - diaminobenzidin (K3468, Dako) selama 2 sampai 5 menit dan diwarnai dengan hematoxylin Mayer. Giant cell granuloma digunakan sebagai kontrol positif untuk semua penanda. Kontrol negatif diperoleh oleh kelalaian antibodi primer dan penggantian antibodi primer dengan serum kelinci nonimun (X0902, Dako). 7.
2.11.2. Imunohistokimia Metode Nonaka
Sampel di deparafinisasi dan diberi cairan emersi 3 % hidrogen perosida. Selanjutnya dicuci dengan PBS (Phosphate-buffered saline). Setelah dilakukan perendaman dalam normal serum, selanjutnya inkubasi dengan antibodi primer
Universitas Indonesia dalamsuhu kamar. Kemudian dilakukan pencucian sebanyak dua kali dengan PBS, dan dilakukan pelabelan dengan kompleks streptevidin biotin (LSAB + system HRP; dako,Carpinteria, CA) dalam suhu ruangan guna mengikat antibodi primer. Aktivitas peroksida yang terlihat berwarna coklat (cairan DAB +; Dako, Carpentirea, CA). Selanjutnya dilakukan pewarnaan dengan Mayer’s haematosilin. Positif kontrol dengan mengunakan Giant cell tumor untuk RANKL, dan OPG, dan hemangioma kapiler digunakan sebagai positif kontrol untuk CD34 dan α-SMA. 33.
Pada penelitian ini digunakan metode langsung/ direct, dengan antibodi polyklonal yang dipilih guna mendapatkan spesifitas untuk epitop tunggal sehingga bersifat lebih spesifik terhadap antigen target. Sedangkan negatif kontrol dengan antibodi primer dan penganti antibodi primer dengan nonimun serum kelinci. Antibodi primer akan di tempatkan pada antigen yang diinginkan, sedangkan antibodi sekunder akan di tempatkan pada immonoglobulin dari spesies antibodi primer.