UNIVERSITAS INDONESIA
EVALUASI EKSPRESI RANKL DAN OPG PADA AMELOBLASTOMA TIPE FOLIKULAR, TIPE PLEKSIFORM , DAN TIPE CAMPURAN
( Penelitian pada Pasien RSCM periode Januari 2008 – Agustus 2012)
TESIS
WENNY YULVIE 0706195945
Pembimbing
Prof. DR. drg. Benny S. Latief, Sp. BM (K) dr. Diah Rini Handjari, Sp. PA (K)
FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI PROGRAM STUDI ILMU BEDAH MULUT DAN MAKSILOFASIAL
JAKARTA DESEMBER 2012
EVALUASI EKSPRESI RANKL DAN OPG PADA AMELOBLASTOMA TIPE FOLIKULAR, TIPE PLEKSIFORM, DAN TIPE CAMPURAN
( Penelitian pada Pasien RSCM periode Januari 2008 - Juli 2012)
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Spesialis dalam
Ilmu Bedah Mulut
WENNY YULVIE 0706195945
FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI
PROGRAM STUDI ILMU BEDAH MULUT DAN MAKSILOFASIAL
JAKARTA DESEMBER 2012
iii
KATA PENGANTAR
Assalamu’alaikum warahmatullahi wabarakatuh
Puji syukur saya panjatkan kehadirat Allah SWT, atas Rahmat dan perkenan-Nya saya dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Evaluasi Ekspresi RANKL dan OPG pada Ameloblastoma tipe Folikular, tipe Pleksiform, dan tipe Campuran” dapat diselesaikan dengan baik dan merupakan salah satu syarat akademik untuk menyelesaikan Program Pendidikan Dokter Gigi Spesialis Bedah Mulut Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Indonesia.
Penelitian dan penulisan tesis ini tidak mungkin dapat diselesaikan tanpa bantuan, bimbingan dandukungan moril dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini, perkenankan penulis untuk menyampaikan ucapan terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada yang terhormat:
1. Pertama-tama saya sampaikan penghargaan dan rasa terima kasih saya kepada Prof.drg. Benny S Latief, SpBM (K) sebagai guru saya dan pembimbing utama dalam tesis ini. Saya ucapkan terima kasih atas segala pengorbanan, perhatian dan kesabaran selama membimbing saya, sejak persiapan hingga penulisan akhir tesis ini. Beliau adalah Bapak, guru yang bagi saya membuat saya lebih tahu arah mana yang akan saya tumpuh. Terima kasih Prof. Benny semoga Allah SWT selalu memberikan kesehatan dan limpahan kasih dan sayang-Nya kepada Prof Benny.
2. Terima kasih kepada dr. Diah Rini Handjari Sp. PA (K), yang juga sebagai pembimbing tesis ini yang selalu memberikan masukan dalam penulisan ini, ditengah kesibukan beliau selalu senantiasa menyempatkan diri untuk dapat berdiskusi dengan saya untuk terus dapat mengembangkan tesis yang sedang saya kerjakan. Semoga Allah SWT membalas amal ibadah dan kebaikan yang telah diberikan.
3. Terima kasih Kepada Prof. drg. Iwan Tofani Sp.BM (K), atas Segala bimbingan dan pencerahannya ya Prof Iwan, Semoga Prof. Iwan selalu sehat, dan mendapatkan Barokah dari Allah SWT Amien.
4. UcapanTerimakasihdan rasa hormatsayasampaikankepadaDekan FKG UI Prof.drg. Bambang Irawan,PhD yang telah memberikan kesempatan dan rekomendasi kepada penulis untuk mengikuti PPDGS Bedah Mulut di FKG UI. Semoga Allah SWT senantiasa memberikan kesehatan kepada Prof Bambang.
5. Sembah sujud dan terima kasih yang tidak terhingga saya haturkan kepada orang tua yang saya cintai dan kasihi Murni Moch Noer, atas doa restu dan dorongan semangat.
6. Ucapan Terima kasih yang tak terhingga kepada Kordinator Pendidikan Spesialis Bedah Mulut FKG UI ; Dr.drg. Corputty Johan E.M Sp. BM,; Dokter Ronny merupakan Inspirasi saya untuk menjadi seorang Spesialis Bedah Mulut semoga Tuhan Yang Maha Kuasa selalu memberikan kesehatan dan kebahagian pada Dokter Ronny.
7. Rasa Hormat dan ucapan Terima kasih saya sampaikan kepada guru-guru saya drg. Anna Pasaribu Sp.BM, drg. Teguh Imam Santoso Sp. BM (almarhum), Dr.drg. Chusnul Chotimah P, Sp.BM, drg. Zulkarnaen Sp. BM, serasa guru – guru saya seperti orang tua saya yang selalu siap mengarahkan anaknya. Trima kasih dan semoga Allah SWT membalas segala amal ibadah yang telah diberikan. Rasa hormat dan jutaan terima kasih juga saya sampaikan kepada drg. Abdul Latif Sp. BM, yang selalu sabar menghadapi mahasiswanya,. drg Pradono Sp.BM, dengan senyum dan lawakannya ya dok, drg Dedy S Sp. BM, drg Lilies D.S Sp. BM, drg. Evi Eida Vitrya Sp. BM, terima kasih banyak dokter Evi dan dokter Lilies untuk bimbingan penulisan proposal sehingga saya bisa menyelesaikan penelitian saya dan mendapat penghargaan di ACOMS Bali 2012., drg. Retnowati Sp. BM, drg C. Rini S. Sp BM., drg. Vera Julia Sp. BM, drg. Dwi Ariawan Sp. BM (Makasih ya Bang Dwi atas kesabarannya membimbing, dan mengajarkan saya), drg. Etty Soenartini, Sp.BM, guru yang selalu tersenyum bila berjumpa dengan saya, dan drg. Muhammad Syafrudin Hak, Sp. BM, (K), Terima Kasih dokter Syaf untuk ilmu tentang Cleft.
8. Terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya saya sampaikan kepada Kepala Departemen Patologi anatomi FKUI/RSCM dr Endang SR,
v
Hardjolukito, MS. SpPA(K), yang telah memberikan ijin penelitian di Lab Patologi Anatomi RSCM.
9. Secara khusus penghargaan dan terima kasih saya sampaikan kepada istriku tercinta dr. Fitriyani Ichsan yang memberikan Cinta dan kasih sayangnya, dan anak-anakku tersayang Abang Rezvan Raditya Yulvie dan adek Rhaisya Althahunisha Yulvie yang selalu menjadi Cahaya di hatiku, pendorong semangat dalam menyelesaikan pendidikan ini. Dan kepada kakaku; Da’Den, Taci Diah, serta adik-adiku Achmad, dan Ali. Terima kasih atas segala dukungan, dan doanya.
10. Teman-teman residen PPDGS-Bedah Mulut, Kurnia Natalia (mbak Iyeng), Rachmitha, dan teman – teman seangkatan yang selalu berbagi dalam tertawa, dan untuk masa-masa terindah dalam menjalankan pendidikan, Arfan Badeges terima kasih ya Fan untuk bantuannya baik di OK maupun selama pembuatan tesis ini, terimakasih Rahmi untuk bantuan dan kue - kue enak dari Medan, terima kasih Dimas buat bantuan dan diskusinya selama saya menyelesaikan tesis ini, serta Indira atas semua bantuan dan kebaikannya. Begitu juga dengan Ninung, dan Arbi saya ucapkan terima kasih atas segala kerja sama, dukungan dan bantuannya.
11. Terima Kasih Kepada Teman- Teman Residen Bedah FKUI- RSCM selama saya menjalani pendidikan Bedah Dasar; Eko, Irwan, Affan, Yudi, Mike, Dzikri, Adit, David, Tomy, Andri, Uut, Ming, Puri, Nungki, Risa. 12. Ucapan terima kasih kepada rekan – rekan PPDGS Bedah Mulut lainnya,
Marik, Eky, Kadri, Bayu, Dian, Hetty, Reva, Agung, Semi, dan Dani. Serta rekan lainnya yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu.
13. Ucapan Terima Kasih Kepada Pak Sahir, Mbak Supri, mbak Rani, mbak Fanny atas semua kebaikan, dan bantuannya selama saya menjalani Pendidikan semoga Allah SWT selalu melimpahkan Rahmat dan Barokahnya. amien
14. Tidak lupa saya ucapkan terima kasih kepada seluruh subyek penelitian. Begitu pula kepada perawat Poli Bedah Mulut, mbak Sari, Bu Tini, dan suster Eni. Perawat OK 12; Mas Indra, mbak Eike, dan Mbak Nunik, dan tak lupa Mas Darman, dan staf administrasi Departemen Patologi Anatomi
RSCM pak Dedy, Pak Udin, Pak Putu, dan Mbak Upi atas dukungan dan bantuannya.
15. Terima kasih kepada pak Asep Rahmat Hidayat, Pak Enoh dan pak Suryanto, serta pak Kusdrajat yang telah membantu penulis di perpustakaan FKG UI selama menjalani pendidikan semoga Allah SWT memberikan rahmat dan barokah Nya.
Semoga Allah SWT senantiasa melimpahkan Rahmat dan Hidayah-Nya serta membalas budi baik semua pihak yang membantu saya dalam menjalani pendidikan hingga selesainya penulisan tesis ini. Disamping itu saya juga menyampaikan di bukakan pintu maaf yang seluas - luasnya atas segala kekhilafan yang terjadi selama masa pendidikan.
Akhirnya saya menyadari bahwa penelitian ini jauh dari sempurna, namun diharapkan dapat membermanfaat bagi pengembangan ilmu kedokteran gigi, khususnya bidang Bedah Mulut.
Wassalamu’alaykum warahmatullahi wabarakatuh Jakarta, Desember 2012
ABSTRAK
Nama : Wenny Yulvie
Program Studi : Spesialis Bedah Mulut
Judul:Evaluasi : Ekspresi RANKL dan OPG pada Ameloblastoma Tipe Folikular, Tipe Pleksiform, dan Tipe Campuran. ( Penelitian pada Pasien RSCM Januari 2008 – Agustus 2012)
Latar Belakang : Ameloblastoma merupakan tumor odontogenik yang dijumpai pada tulang rahang. Tumbuh lambat dan berpotensi agresif terlihat dari mekanisme ekspansi kedalam tulang rahang. Receptor activator of nuclear factor-ĸB ligand (RANKL) dan Osteoprotogerin (OPG) merupakan protein yang mengatur osteoklastogenesis dimana kedua agen diklasifikasikan kedalam superfamili TNF. Tujuan : Menganalisis sifat invasif local ameloblastoma melalui ekspresi RANKL dan OPG pada berbagai tipe ameloblastoma.
Metode Penelitian : 40 sampel ameloblastoma terdiri dari 9 sampel ameloblastoma tipe pleksiform, 15 sampel tipe folikular, dan 16 sampel tipe campuran. Sampel dipulas secara imunohistokimia dengan antibody RANKL dan OPG poliklonal kelinci .
Hasil: Perbandingan RANKL dengan OPG pada ameloblastoma tipe pleksiform dan campuran memiliki nilai RANKL lebih besar OPG yang cukup besar, dibandingkan tipe folikular, sehingga kedua tipe tersebut dapat di katagorikan lebih dekstruktif dibandingkan tipe folikular. Perbandingan RANKL lebih kecil OPG pada tipe folikular sebesar 66,67 %. Hal ini mengambarkan pada tipe folikular lambat dalam perkembangannya, sedangkan perbandingan antara RANKL sama dengan OPG skor terbesar pada tipe campuran yakni sebesar 37,5 % hal ini berarti pada tipe campuran meskipun memilik kecendrungan dekstruktif namun dapat bersifat hemostasis.
Kesimpulan :Terdapat perbedaan ekspresi RANKL dan OPG pada ke tiga tipe ameloblastoma dimana pada tipe pleksiform memiliki rasio RANKL dan OPG yang lebih tinggi dibandingkan kedua tipe yang lainnya. Ketidak seimbangan tersebut dapat menyebabkan kerusakan tulang dapat berlangsung lebih cepat. Kata kunci: ameloblastoma, invasif lokal, rankl,opg, dan imunohistokimia
ix ABSTRACT
Name : Wenny Yulvie Study Program : Ilmu Bedah Mulut
Title : Ekspresi RANKL dan OPG pada Ameloblastoma Tipe Folikular, Tipe Pleksiform, dan Tipe Campuran. ( Penelitian pada Pasien RSCM Januari 2008 – Agustus 2012)
Background: Ameloblastoma is an odontogenic tumor is slow growing and aggressive of expansion into the jaw bone. Receptor activator of nuclear factor-ĸB ligand (RANKL) and Osteoprotogerin (OPG) protein that regulates osteoclastogenesis, both agents are TNF superfamily. Although benign, the ameloblastoma is destrutive tumor, locally invasive and presents a high rate of recurrence despite adequate surgical removal.
Objective: To analyze the nature of local invasive ameloblastoma through the expression of RANKL and OPG Methods: 40 samples plexiform type ameloblastoma (n = 9), follicular type (n = 15), and mixed type (n = 16) by immunohistochemistry. Results: Comparison of RANKL and OPG in ameloblastoma plexiform type, follicular type, and mixed type values had greater expression of RANKL than OPG substantial plexiform type and mixed type, 66.67% of cases showed a greater expressin of OPG than RANKL type of follicular. RANKL same OPG biggest score of 37.5% on a mixed type. Conclusion: There are differences in the expression of RANKL than OPG in plexiform type and mixed type has a higher ratio than the follicular type. Imbalances can cause locally invasive will go faster to resorption in jaw. Key words: ameloblastoma, locally invasive, rankl, opg, and
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ...i
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ...ii
LEMBAR PENGESAHAN ...iii
KATA PENGANTAR ... iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ...viii
ABSTRAK ...ix
ABSTRACT ...x
DAFTAR ISI ...xi
DAFTAR GAMBAR ... xiv
DAFTAR TABEL ...xv
DAFTAR LAMPIRAN ...xvi
BAB 1 PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang ...1
1.2. Rumusan Masalah Penelitian ...3
1.3. Tujuan penelitian ...4 1.3.1. Tujuan Umum ...4 1.3.2. Tujuan Khusus ...4 1.4. Manfaat Penelitian ...4 1.4.1. Manfaat Teoritis ...4 1.4.2. Manfaat Praktis ...5
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Ameloblastoma ...6
2.2. Epidemiologi ...6
2.3. Etiologi ...7
2.4. Klasifikasi ...7
2.4.1. Ameloblastoma Konvensional Padat atauMultikistik(Intraosseus)..8
2..4.2. AmeloblastomaUnikistik ...8
xi 2.5. GambaranKlinis ...8 2.6. GambaranHistopatologik...9 2.6.1. AmeloblastomaKonvensionalPadat / Multikistik ...9 2.6.2. AmeloblastomaUnikistik...12 2.6.3. Ameloblastoma Periperal ...13 2.7. Perawatandan Prognosis ...14 2.8. BiologiDasarTulang ...15 2.8.1. SelOsteoblas ...15 2.8.2. SelOsteoklas ...16 2.9. SistemOPG-RANK, danRANKL ...17 2.9.1. OPG(Osteoprotogerin)...17 2.9.2. RANK ...18 2.9.3. RANKL ...18
2.10. RANK, RANKL, danOPGpadaAmeloblastoma ...19
2.11. Imunohistokimia ...20
2.12. KerangkaTeori ...23
BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS 3.1. KerangkaKonsep ...24
3.2. Hipotesis ...24
BAB 4 METODOLOGI PENELITIAN 4.1. DesainPenelitian ...25 4.2. TempatdanWaktu ...25 4.3SampelPenelitian ...25 4.4AlurPenelitian...26 4.5. KriteriaInklusi ...27 4.6. KriteriaEksklusi ...27 4.7. VariabelPenelitian ...27 4.8. DefinisiOperasional ...28 4.9. BahandanAlatKerjaPenelitian ...30 4.10. ProsedurKerja ...31
4.11.Manajemen Data danAnalisis Data ...33
BAB 6 PEMBAHASAN...47
BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN 7.1 Kesimpulan ...52
7.2 Saran ...54
DAFTAR PUSTAKA...55
xiii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.6.1.1 : Ameloblastoma tipe folikuler ... 9
Gambar 2.6.1.2. : Ameloblastoma tipe pleksiformis ... 10
Gambar 2.6.1.3 : Ameloblastoma tipe akantomatosa ... 10
Gambar 2.6.1.4 : Ameloblastoma tipe sel granular ... 11
Gambar 2.6.1.5 : Ameloblastoma tipe desmoplastik ... 11
Gambar 2.6.1.6 : Ameloblastoma tipe sel basaloid ... 12
Gambar 2.6.2.1 : Ameloblastoma tipe luminal ... 12
Gambar 2.6.2.2 : Ameloblastoma tipe intra luminal ... 13
Gambar 2.6.2.3 : Ameloblastoma tipe mural ... 13
Gambar 2.6.3. : Ameloblastoma tipe periperal ... 14
Gambar 2.12. : Skema kerangka teori penelitian. ... 23
Gambar 3.1. : Kerangka Konsep penelitian ... 24
DAFTAR TABEL
Tabel5.1. DistribusiPasienBerdasarkanJenisKelamin... 34 Tabel 5.2. Distribusi Pasien Berdasarkan Usia... 35 Tabel 5.3. Distribusi Sampel Berdasarkan jenis histopatologi
ameloblastoma ... 35 Tabel 5.4. Distribusi skor imunoekspresi OPG ameloblastoma tipe
pleksiform dengan tipe folikular... 36 Tabel 5.5. Distribusi sko imunoekspresi RANKL ameloblastoma tipe
pleksiform dengan tipe folikular... 37 Tabel 5.6. Distribusi skor imunoekspresi OPG ameloblastoma tipe
pleksiform dengan tipe campuran... 38 Tabel 5.7 Distribusi skor imunoekspresi RANKL ameloblastoma tipe
pleksiform dengan tipe campuran... 39 Tabel 5.8 Distribusi skor imunoekspresi OPG ameloblastoma tipe
folikular dengan tipe campuran... 40 Tabel 5.9 Distribusi skor imunoekspresi RANKL ameloblastoma tipe
folikular dengan tipe campuran... 41 Tabel5.10. Distribusi Perbandingan RANKL dan OPG... 42 Tabel 5.11 Distribusi skor imunoekspresi OPG ameloblastoma sesuai
kelompok usia dibawah 30 tahun dengan diatas 30 tahun... 43 Tabel 5.12 Distribusi skor imunoekspresi RANKL ameloblastoma sesuai
usia dibawah 30 tahun dengan diatas 30 tahun... 44 Tabel 5.13 Ringkasan sampel penelitian dengan Skor ekspresi RANKL
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 : Surat ijin Penelitian ... 58 Lampiran 2 : Surat Keterangan Lolos Etik ... 59 Lampiran 3 : Uji Perbandingan OPG ameloblastoma tipe
Pleksiform dengan tipe Folikular... 60 Lampiran 4 : Uji Perbandingan RANKL ameloblastoma tipe
Pleksiform dengan tipe Folikular ... 61 Lampiran 5 : Uji Perbandingan OPG Ameloblastoma tipe
Pleksiform dengan tipe Campuran. ... 62 Lampiran 6 : Uji Perbandingan RANKL ameloblastoma tipe
Pleksiform dengan tipe Campuran ... 63 Lampiran 7 : Uji Perbandingan OPG ameloblastoma tipe
Folikular dengan tipe Campuran. ... 64 Lampiran 8 : Uji Perbandingan RANKL ameloblastoma tipe
Folikular dengan tipe Campuran. ... 65 Lampiran 9 : Distribusi Hubungan antara RANKL dan OPG... 66 Lampiran 10 : Distribusi skor perbandingan OPG antara sampel
usia > 30dengan usia < 30... 68 Lampiran 11 : Distribusi skor perbandingan RANKL antara
sampel usia > 30 dengan usia < 30... 70 Lampiran 12 : Ringkasan antara Jenis ameloblastoma, Skor
imunopositif, Skor intensitas, dan skor
imunoekspresi RANKL, dengan OPG... 71 Lampiran 13 : Alat- alatdanBahan... 72 Lampiran 14 : Gambar Hasil Imunohistokimia OPG dalam
pembesaran mikroskop 400 x ... 74 Lampiran 15 : Gambar Hasil Imunohistokimia RANKL dalam
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1
Latar Belakang Masalah
Ameloblastoma merupakan tumor odontogenik yang kerap dijumpai pada tulang rahang. Ameloblastoma menurut Reichart dkk. (1995) sekitar 3 – 19 % dari semua tumor dan kista pada rahang dan Cawson (2001) sekitar 12 % dari semua tumor odontogenik.1 Menurut Reichart dkk. (1995) sering dijumpai pada usia 33-44 tahun, sekitar 85 % dari ameloblastoma konvensional terjadi pada mandibula, terutama di daerah body - ramus ascenden, dan 15 % terjadi pada rahang atas terutama di daerah posterior.1. Ameloblastoma secara histopatologi bersifat jinak berasal dari epitel odontogenik yang terlibat dalam proses pembentukan gigi.1,2. Tumbuh lambat dan berpotensi agresif terlihat dari mekanisme ekspansi kedalam tulang rahang dan dapat melewati lapisan terkeras dari struktur tulang / korteks sampai menginfiltrasi jaringan lunak sekitarnya sehingga berhubungan dengan tingginya tingkat rekurensi terutama pada ameloblastoma solid/multikistik.2 Penatalaksanaan ameloblastoma masih sering diperdebatkan beberapa penulis menyarankan tindakan secara konservatif, namun di pihak lain banyak pula yang lebih memilih tindakan radikal yang tentunya dapat menimbulkan masalah dengan rahabilitasnya. Penatalaksanaan ameloblastoma sampai saat ini masih menjadi kontroversial karena perilaku biologis unik dari tumor yang tumbuh lambat, lokal invasif, dan dengan tingkat rekurensi yang tinggi.2,3.
Di Indonesia penelitian mengenai kasus ameloblastoma masih jarang. Hasil penelitian pendahuluan Yulvie dan Latief (2011) secara histopatologi tipe terbanyak ameloblastoma tipe pleksiform ( 31,43 %) , kemudian ameloblastoma tipe folikular ( 30,00 % ), dan ameloblastoma tipe campuran antara folikular dengan tipe pleksiform ( 25,70 %).4. Sedangkan menurut Reichart dkk (1995) mendapatkan bahwa terbanyak ameloblastoma tipe folikular ( 33,9 % ), dan tipe
2
Universitas Indonesia pleksiform (30,2 %), dan dari kedua tipe tersebut tipe folikular yang paling sering mengalami rekurensi.1.
Rekurensi pada ameloblastoma dilaporkan 10 % - 20 % setelah tindakan enukleasi dan kuretase pada tipe unikistik ameloblastoma, dan sebesar 50 % - 90 % setelah tindakan kuretase pada tipe padat/multikistik ameloblastoma.4,5. Beberapa ahli menyarankan untuk perawatan secara radikal pada ameloblastoma tipe padat/multikistik dengan mereseksi 1-2 cm dari tepi tumor.5.
RANKL (Receptor activator of nuclear factor-ĸB ligand) dan OPG (Osteoprotogerin) merupakan protein yang mengatur osteoklastogenesis dimana kedua agen diklasifikasikan ke dalam superfamili TNF. RANKL bekerja dengan cara mengikat reseptor pada permukaan preosteoklas (RANK) merangsang diferensiasi dan aktivasi menjadi osteoklas matang sehingga mengakibatkan terjadinya resopsi tulang namun adanya OPG yang diproduksi oleh sel osteoblas merupakan reseptor lainnya dari RANKL berfungsi menghambat osteoklastogenesis dengan cara berikatan dengan RANKL sehingga tidak terjadi pematangan sel osteoklas dari preosteoklas melainkan menyebabkan apoptosis atau kematian sel preosteoklas yang terprogram.6 .
Beberapa peneliti telah melakukan penelitian sebelumnya diantaranya Kumamoto dan Ooya (2004) melaporkan adanya nilai ekspresi OPG (+) yang lebih tinggi dibandingkan nilai ekspresi RANKL (+) pada sel-sel ameloblastoma, dan terdapat nilai ekspresi RANKL (+) yang tinggi pada ameloblastoma tipe pleksiformis dibandingkan tipe folikularis sehingga diduga perbedaan tersebut berperan besar dalam diferensiasi sel tumor dan struktur jaringan tumor pada ameloblastoma.6. Kemudian Da Silva dkk (2008) melaporkan juga bahwa terjadi peningkatan jumlah rasio ekspresi RANKL (+) / OPG (+) lebih tinggi pada ameloblastoma padat / multikistik dibandingkan dengan ameloblastoma unikistik, kista dentigerus, dan folikel gigi. Sehingga pada kenyataanya ameloblastoma multikistik lebih bersifat invasif lokal, menginfiltrasi sampai ke tulang medulari, dan memiliki tingkat rekurensi yang tinggi.7. Analisis tersebut sesuai dengan penelitian secara in vitro yang di lakukan oleh Sandra dkk (2005) mengatakan bahwa ameloblastoma dengan mensekresi RANKL dan TNFα dapat menginduksi osteoklastogenesis sehingga menimbulkan ruang untuk berinvasif didalam tulang
rahang.8. Sementara Qiang dan Huang (2010) mengatakan adanya peran RANKL dalam resorpsi tulang yang disebabkan oleh ameloblastoma, secara esensial dalam menginduksi osteoklastogenesis oleh sel-sel ameloblastoma, dan OPG berperan sebaliknya.9. Mereka menduga adanya korelasi antara perbedaan ekspresi RANKL dengan tipe histologi dan sifat biologis ameloblastoma, namun secara khusus belum dapat menjelaskan apakah terdapat korelasi antara persentasi RANKL dan OPG dengan sifat invasif maupun ekspansi dari ameloblastoma.6-9.
Penelitian ini bertujuan untuk lebih memahami dan menganalisa sifat dari ameloblastoma sehingga penderita ameloblastoma dapat ditatalaksana secara adekuat dan mencegah terjadinya rekurensi. Selama ini penelitian mengenai sifat biologi dan sifat invasif ameloblastoma di Indonesia masih belum banyak dilakukan dari literatur – literatur yang penulis temukan belum ada yang meneliti pada ameloblastoma tipe campuran, dan mengelompokan pada kelompok usia. Karenanya penelitian ameloblastoma ini juga untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan sifat invasif lokal antara penderita usia diatas 30 tahun dengan usia sama atau dibawah 30 tahun mengingat ameloblastoma lebih banyak ditemukan pada dekade 3-4 dalam kehidupan manusia.
1.2 Rumusan Masalah Penelitian
Berdasarkan uraian dalam latar belakang masalah diatas maka memberikan dasar pemikiran kepada peneliti untuk merumuskan pertanyaan penelitian sebagai berikut:
1. Apakah ada perbedaan nilai ekspresi OPG pada ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran (pleksiform-folikular).
2. Apakah ada perbedaan nilai ekspresi RANKL pada ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran (pleksiform-folikular).
3. Apakah ada perbedaan perbandingan RANKL / OPG pada ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran (pleksiform-folikular). 4. Apakah terdapat perbedaan rerata nilai ekspresi OPG pada penderita
ameloblastoma di usia < 30 tahun, dengan usia > 30 tahun.
5. Apakah terdapat perbedaan rerata nilai ekspresi RANKL pada penderita ameloblastoma di usia < dengan 30 tahun, dengan usia > 30 tahun.
4 Universitas Indonesia 1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1 Tujuan Umum
Menganalisis sifat invasif lokal ameloblastoma melalui ekspresi RANKL dan OPG pada ameloblastoma tipe folikular, ameloblastoma tipe pleksiform, dan ameloblastoma tipe campuran.
1.3.2 Tujuan Khusus
Tujuan khusus penelitian ini adalah:
1. Menganalisis ekspresi RANKL pada ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran.
2. Menganalisis ekspresi OPG pada ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran.
3. Menganalisis perbandingan ekspresi RANKL / OPG pada
ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran.
4. Menganalisis ekspresi RANKL pada pasien usia < 30 tahun dengan membandingkan usia > 30 tahun.
5. Menganalisis ekspresi OPG pada pasien usia < 30 tahun dengan membandingkan usia > 30 tahun.
1.4 Manfaat Penelitian
Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan akan dapat: 1.4.1 Manfaat Teoritis
1. Memberikan kontribusi dan menambah informasi penting dalam upaya mengungkap pengaruh ekspresi RANKL, dan ekspresi OPG khususnya mengenai sifat invasif lokal dari berbagai tipe histologi ameloblastoma.
2. Memberikan informasi mengenai perbedaan nilai ekspresi RANKL dan Nilai ekspresi OPG pada penderita ameloblastoma dalam < 30 tahun dan usia > 30 tahun.
3. Menjadi dasar pertimbangan dalam tindakan penatalaksanaan ameloblastoma bagi organik Poli Bedah Mulut di RSCM, dengan harapan dapat ditingkatkan penanganan kasus ameloblastoma sehingga diperoleh hasil yang lebih maksimal.
1.4.2 Manfaat Praktis
1. Menjadi landasan ilmiah untuk pelaksanaan dan pengembangan penelitian selanjutnya mengenai RANKL dan OPG dalam mempelajari invasif lokal ameloblastoma.
2. Sebagai dasar penelitian lanjutan guna memahami sifat biologis ameloblastoma.
3. Penelitian ini bertujuan untuk lebih memahami sifat dari ameloblastoma sehingga penderita ameloblastoma dapat ditatalaksana secara adekuat, dan mencegah terjadinya rekurensi.
6
Universitas Indonesia
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Ameloblastoma
WHO (1992) mengklasifikasikan ameloblastoma merupakan tumor epitelial odontogenik yang jinak tapi locally invasive.10. Asal Kata “Ameloblastoma” dikemukakan oleh Churchill (1934) untuk menggantikan kata “adamantinoma” yang diperkenalkan oleh Malassez (1885) karena adamantinoma berarti pembentukan jaringan keras namun kenyataanya tidak ditemukan adanya jaringan keras dalam tumor ini.11-13. Menurut Robinson (1977) ameloblastoma merupakan tumor epitelial odontogenik yang paling umum terjadi tumor yang unisentrik, nonfungsional, dan intermiten dalam pertumbuhan, secara anatomis jinak dan secara klinis persisten.12 Pendapat Shafer (1983) menyatakan bahwa ameloblastoma adalah neoplasma sejati dari suatu jaringan dengan tipe organ enamel yang tidak mengalami diferensiasi sampai ke titik pembentukan enamel.13. Caldwell, Separsky, dan Luccbesi (1970) serta Shatkin dan Hoffmeister (1965) menyatakannya sebagai tumor yang locally malignant dengan pertumbuhan yang persisten.14
2.2. Epidemiologi
Studi insiden ameloblastoma menurut Reichart (1995) mendapatkan 0,6 - 5,6 kasus baru per 1 juta penduduk setiap tahunnya di Swedia, Afrika Selatan, dan Nigeria.1 Menurut penelitian Reichart (1995), antara ras Kaukasus, dengan bangsa Asia ( China, India, Jepang, Melayu, dan Thailand) sebesar 24,8 % dengan berbanding 38,4 % .1. Sementara antara negara industri dengan negara berkembang 27,7 % (n=1102) dengan 39,1 % (n=542).1. Ameloblastoma biasanya timbul pada kelompok usia dewasa, paling sering terjadi pada usia 20 - 50 tahun dengan hampir setengahnya berada pada dekade ketiga dan keempat masa hidupnya dan dua pertiganya berusia kurang dari 40 tahun sesuai penelitian Small dan Waldron (1955), Mehlisch, Dahlin dan Masson (1972).14 Tidak
ditemukan adanya predileksi gender yang signifikan, namun menurut Gorlin (1970) persentase laki-laki lebih besar dibandingkan wanita, yaitu 52 % berbanding 48 % 15 .
2.3. Etiologi
Penyebab ameloblastoma bervariasi, namun pencetus terjadinya proses proliferasi neoplasma jaringan epitelialnya belum diketahui.Di duga tumor ini berawal dari; (1) Sisa sel organ enamel Malassez, baik sisa dari dental lamina maupun selubung Hertwig pada ligament periodontal, (2) Organ enamel yang sedang berkembang, (3) Sisa epitel serres pada gingival, (4) Sel basal dari permukaan epitel pembentuk rahang, (5) Sel basal oral mukosa, hasil dari invaginasi sel basal epitel ke tulang rahang yang sedang berkembang (6) Epitel heterotropik dari bagian tubuh yang lain terutama kelenjar hipofisis (pituitari), yang bermigrasi ke rahang dan, (7) Epitel dari kista terutama kista dentigerous.5 Mekanisme ameloblastoma tumbuh membesar dan menginvasi terlihat pada ekspresi TNF-α, protein anti apoptotik (Bcl-2,Bcl-XL), dan protein interfase (faktor pertumbuhan fibroblas [ FGF], matriks metaloprotein [ MMP]. Ameloblastoma mengalami proliperasi terlihat dalam siklus sel yang berhubungan dalam Ki-67. Mutasi gen p 53 tidak terlihat pada perkembangan atau pertumbuhan ameloblastoma.3.
Kasus ameloblastoma yang berhubungan dengan kista dentigerous pertama kali dilaporkan oleh Cahn (1933), selanjutnya beberapa kasus lain yang menunjukkan adanya keterkaitan antara ameloblastoma dan kista dentigerous dilaporkan oleh antara lain Castner dkk (1967), Dresser dan Segal (1967), Gardner dan Pecak (1980), Hutton (1967), Lee (1970), Quinn dan Fournet (1969) dan Taylor dkk (1971).13,14.
2.4. Klasifikasi
Menurut WHO 2005, klasifikasi ameloblastoma terbagi 4 : Ameloblastoma solid/ multikistik, ameloblastoma ekstraosseus, ameloblastoma desmoplastik, dan ameloblastoma unikistik.
8
Universitas Indonesia Menurut Neville 2002, mengklasifikasikan ameloblastoma berdasarkan tampilan klinis dan radiologis menjadi tiga jenis 5.
2.4.1. Ameloblastoma Konvensional Padat atau Multikistik (Intraosseus) Terjadi pada 86% dari seluruh kasus ameloblastoma. Tipe ini memiliki gambaran histopatologik yang berbeda-beda, yaitu
(1) Tipe Follikular, (2) Tipe Pleksiform, (3) Tipe Akantomatosa , (4) Tipe Sel Granular, (5) Tipe Desmoplatik dan, (6) Tipe Basaloid. 2.4.2. Ameloblastoma Unikistik :
Pertama kali dilaporkan oleh Robinson dan Martinez pada tahun 1977. Presentase kejadian 13% dari seluruh kasus ameloblastoma yang terjadi. Gambaran Histopatologiknya adalah (1) ameloblastoma luminal, (2) ameloblastoma intraluminal dan (3) ameloblastoma mural.5
2.4.3. Ameloblastoma Peripheral (Ekstraosseus) :
Pertama kali dilaporkan oleh Stanley dan Krogh (1959). Hanya 1% kejadian yang ditemukan dari keseluruhan kasus ameloblastoma. Tumor ini mungkin terbentuk dari sisa-sisa epitel odontogenik dibawah mukosa oral atau dari sel basal epitelial dari permukaan epitel atau dari sisa epitel serres pada gingiva. Secara histopatologik memiliki gambaran yang sama dengan bentuk intraoseus dari ameloblastoma.5
2.5 Gambaran Klinis
Ameloblastoma dapat tumbuh menuju ke segala arah, menginvasif jaringan lunak dan menghancurkan tulang baik dengan tekanan langsung maupun dengan memicu resorpsi tulang oleh osteoklas.14. Sebagian besar kasus yang telah dilaporkan menunjukkan bahwa ameloblastoma lebih sering terlihat di mandibula dibanding maksila. Sehdev dkk, (1974) dan Mehlisch dkk, (1972) melaporkan 78% kasus ameloblastoma terjadi di mandibula, Small dan Waldron (1955) melaporkan 80% kasus terjadi di mandibula, begitu juga dengan Cohen, Medak, dan Burlakaw (1972), serta Daramola, Ajagbe, dan Akinyemi (1980).15 Lesi ini
biasanya asymtomatik dan ditemukan lewat pemeriksaan radiografis atau karena ekspansi rahang yang asymtomatik, tetapi jika memiliki gejala akan bervariasi di setiap pasien. Mehlisch dkk (1972) melaporkan gejala paling umum adalah pembengkakan dengan persentase kejadian 75%, diikuti oleh rasa sakit terjadi pada 33% pasien, lalu infeksi sinus 28% dan ulserasi 10%.15
2.6 Gambaran Histopatologik
Menurut Neville (2002) gambaran mikroskopik setiap subtipe ameloblastoma berbeda-beda sesuai dengan klasifikasinya.5
2.6.1 Ameloblastoma Konvensional Padat / Multikistik
2.6.1.1. Tipe Folikular
Paling umum dan mudah dikenali. Pulau-pulau epitelium menggambarkan epitel organ enamel didalam stroma jaringan ikat fibrosa dewasa. sarang-sarang epitel ini terdiri dari inti yang berisi sel anguler menggambarkan retikulum stelata dari organ email. Intinya dikelilingi oleh lapisan tunggal sel kolumnar seperti ameloblas. Pada area lain sel perifernya lebih berbentuk kuboid dan menggambarkan sel basal. Pembentukan kista umum terjadi mulai dari kista mikro hingga kista makro.
Gambar 2.6.1.1 Ameloblastoma tipe folikular (Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouqout JE.
10
Universitas Indonesia 2.6.1.2. Tipe Pleksiform
Terdiri dari benang epitel panjang yang beranastomosis Benang-benang atau lembaran-lembaran epitel tersebut diikat oleh sel mirip ameloblas berbentuk kolumnar dan kuboid, mengelilingi sel epitel yang diatur secara longgar. Stroma memiliki struktur yang longgar dan memiliki vaskularisasi. Pembentukan kista tidak umum terjadi pada ameloblastoma dengan tipe histopatologik ini. Kalaupun ada kista, maka terbentuk dari degenerasi stroma bukan karena perubahan epitelium.
Gambar 2.6.1.2.. Ameloblastoma tipe pleksiform (Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouqout JE. Oral & maxillofacial pathology. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2002: p. 611-6)
2.6.1.3. Tipe Akantomatosa
Ketika metaplasia sel skuamosa yang luas muncul dibagian tengah pulau epitel ameloblastoma folikular maka disebut sebagai acanthomatous ameloblastoma. Secara histopatologik biasanya lesi ini diduga sebagai karsinoma sel skuamosa.
Gambar 2.6.1.3 Ameloblastoma tipe akantomatosa (Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouqout JE. Oral & maxillofacial pathology. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2002: p. 611-6)
2.6.1.4. Tipe Sel Granular
Sel-sel epitel ameloblastoma terkadang berubah menjadi sel-sel granuler, ketika perubahan yang terjadi cukup luas maka disebut ameloblastoma sel granuler. Sel-sel ini memiliki sitoplasma berlimpah yang terisi oleh granul-granul eosinofil.
Gambar 2.6.1.4. Ameloblastoma tipe sel granular (Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouqout JE. Oral & maxillofacial pathology. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2002: p. 611-6)
2.6.1.5. Tipe Desmoplastik
Terdiri dari pulau-pulai kecil dan benang-benang epitel odontogenik didalam stroma yang terkolagenisasi penuh. Studi imunohistochemical menunjukkan produksi sitokin yang mungkin menjadi penyebab desmoplasia. Secara radiografis lesi ini menggambarkan lesi fibro-osseus.
Gambar 2.6.1.5.Ameloblastoma tipe desmoplastik (Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouqout JE. Oral & maxillofacial pathology. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2002: p. 611-6)
12
Universitas Indonesia 2.6.1.6. Tipe Sel Basaloid
Merupakan tipe yang paling jarang terjadi. Lesi ini tersusun dari sarang-sarang sel basaloid yang seragam. Tidak ada retikulum stellata tampak di tengah-tengah sarang. Sel perifernya cenderung kuboid dari pada kolumnar.
Gambar 2.6.1.6. Ameloblastoma tipe sel basaloid (Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouqout JE. Oral & maxillofacial pathology. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2002: p. 611-6)
2.6.2 Ameloblastoma Unikistik 2.6.2.1. Ameloblastoma Luminal
Tumor ini terikat ke permukaan luminal dari kista. Lesi terdiri dari dinding kista fibrosa dengan lapisan yang berisi epitelium ameloblastik baik parsial maupun total. Tampak lapisan basal sel kolumnar atau kuboid dengan inti hiperkromatik yang menunjukkan adanya reverse polarity dan vakuolisasi sitoplasmik basilar.
Gambar 2.6.2.1. Ameloblastoma tipe luminal (Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouqout JE.
2.6.2.2. Ameloblastoma Intraluminal
Adanya nodul-nodul ameloblastoma dari lapisan kista hingga lumen kista. Nodul bisa secara realif kecil atau besar hingga memenuhi lumen kista. Pada beberapa kasus nodul yang berada didalam lumen memperlihatkan pola plexiform dan edematous seperti pada ameloblastoma konvensional, lesi yang seperti ini disebut pelxiform unicystic ameloblastoma.
Gambar 2.6.2.2. Ameloblastoma tipe intra luminal (Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouqout JE. Oral & maxillofacial pathology. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2002: p. 611-6)
Gambar 2.6.2.3. Ameloblastoma Mural
Dinding fibrosa kista diinfiltrasi oleh ameloblastoma plexiform dan folllicullar. Perluasan dan kedalaman infiltrasi ameloblastoma bervariasi.
Gambar 2.6.2.3. Ameloblastoma tipe mural (Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouqout JE.
14
Universitas Indonesia 2.6.3 Ameloblastoma Periperal
Adanya pulau-pulau epitelium ameloblastik pada lamina propria di bawah epitel permukaan. Dapat menunjukkan gambaran ameloblastoma intraosseus, umumnya tipe folikular dan tipe pleksiform.
Gambar 2.6.3 . Ameloblastoma tipe periperal (Neville BW, Damm DD, Allen CM, Bouqout JE.
Oral & maxillofacial pathology. 2nd ed. Philadelphia: W.B. Saunders Co; 2002: p. 611-6)
2.7. Perawatan dan Prognosis
Shatkin dan Hoffmeister (1965), Taylor (1968) dan peneliti lainnya menyatakan karena ameloblastoma invasif dan secara klinis ganas maka satu-satunya perawatan yang rasional yaitu eksisi luas.11 Menurut Becker dan Pertl perawatan ameloblastoma terbagi dalam tiga kelompok besar yaitu (1) radioterapi, (2) perawatan konservatif dan (3) operasi radikal. Rekurensi yang terjadi pada reseksi segmental ini paling sedikit dibandingkan perawatan lainnya. Penatalaksanaan ameloblastoma telah menjadi kontroversial karena perilaku biologis unik dari tumor ini; tumbuh lambat, invasif lokal dengan tingkat rekurensi tinggi.16. Menurut Nevile (2002), rekurensi pada ameloblastoma dilaporkan 10 % - 20% setelah tindakan enukleasi dan kuretase pada unikistik ameloblastoma, dan sebesar 50% - 90% setelah tindakan kuretase pada tipe multikistik ameloblastoma.5 Oleh karena itu, reseksi luas dan tepi sayatan bebas tumor 0,5 - 1 cm dari batas tumor pada tipe padat / multikistik sangat direkomendasikan.. Beberapa ahli seperti; Gardner DG (1984), Gortzak RA dkk (2006),Carlson ER dkk (2006) , Rastogi V dkk (2010) merekomendasikan untuk perawatan secara radikal pada ameloblastoma multikistik dengan mereseksi 1-2 cm dari tepi tumor.15,16.
2.8 Biologi Dasar Tulang
Tulang adalah jaringan ikat yang membentuk sistem rangka atau skletal berfungsi menyokong tubuh (mekanik), melindungi organ-organ vital tubuh (protektif), dan sebagai tempat menyimpan cadangan metabolisme mineral, terutama kalsium dan fosfat (metabolik), dan sebagai tempat pembentukan sel-sel darah (hemopoetik).17 Tulang terdiri dari 33 % substansi organik, dan 67 % substansi anorganik. Substansi anorganik merupakan komponen mineral kalsium dan fosfat terutama terdapat sebagai kristal hidroksi apatit yang didepositkan pada serabut kolagen sehingga tulang bersifat keras, namun tetap elastis. Sedangkan substansi organik antara lain sel-sel tulang (osteoblas, osteoprogenitor, osteoklas, dan osteosit), dan matriks tulang yang terdiri dari kolagen tipe I sebesar 28 %, serta protein nonkolagen sebesar 5 %.18 Sementara protein nonkolagen yang disekresikan oleh sel osteoblas akan terikat pada substansi mineral tulang, yang berperan dalam regulasi dan homeostasis tulang itu sendiri. Secara mikro tulang terbagi dua yakni tulang kortikal / tulang kompak dan tulang trabekular / spongiosa/tulang kanselus. Serat-serat kolagen yang terdapat pada tulang kortikal berjalan membentuk lamella yang konsentris, sedangkan pada tulang trabekular tersusun dengan baik sehingga tampak lebih porus. Perbedaan kedua jenis tulang tersebut sesuai dengan fungsi masing-masing tulang tersebut yakni fungsi mekanik dan protektif dilakukan oleh tulang kortikal, sedangkan fungsi metabolik oleh tulang trabekular. 17,18.
2.8.1 Sel Osteoblas
Osteoblas adalah sel pembentuk tulang berasal dari proliferasi stem sel mesenkim pada sumsum tulang dan periosteum.17 Osteoblas yang matur dapat mensekresikan matriks tulang terdiri atas kolagen tipe I, protein non kolagen dan proteoglikan. Beberapa protein nonkolagen yang disintesis oleh osteoblas adalah fosfatase alkali, osteokalsin, osteopontin, sialoprotein dan faktor pertumbuhan. Bentuk selnya seperti kuboid, piramidal dan seringkali berwujud lembaran utuh yang menyerupai susunan epitel.18 Berinti besar dan mempunyai satu anak inti. Dengan sitoplasma yang basofil karena terdapat nukleoprotein yang berperan mensintesis unsur organik matriks tulang. Membran plasma osteoblas
16
Universitas Indonesia mengandung enzim alkali fosfatase, yang menandakan bahwa osteoblas tidak saja berhubungan dengan pembentukan matriks kolagen tulang, namun berhubungan juga dengan proses kalsifikasi. 17,18.
2.8.2 Sel Osteoklas
Osteoklas adalah sel yang berperan dalam proses resorpsi tulang. Berasal dari stem sel hematopoietik yang terdapat pada sumsum tulang dan limpa. Osteoklas merupakan sel dengan banyak inti /multinuklear, berukuran besar sehingga mudah dikenali, dan bertangung jawab dalam proses resorpsi tulang.17 Sel osteoklas berasal dari progenitor makrofag di sumsum tulang, dan pada proses pembentukan sampai perkembangannya memerlukan faktor solubel yang didapat dari osteoblas.18 Osteoklas memiliki struktur yang unik yakni dengan inti didalamnya terdapat mitokondria yang sangat banyak, ribosom, lisosom, yang berdiri sendiri dengan kompleks golgi yang luas. Siklus terjadinya resorpsi di tulang dimulai dengan melekatnya osteoklas pada permukaan tulang yang akan diresorpsi, kemudian berpolarisasi membentuk zona sealing, yang pada akhirnya terjadi pemisahan komponen yang terdapat dalam tulang hingga proses kematian sel yang terprogram (apoptosis).17,18. Pembentukan osteoklas (osteoklastogenesis) dimulai saat stem sel hematopoietik distimulasi untuk membentuk sel mononuklear, kemudian berdiferensiasi menjadi preosteoklas, yang selanjutnya dilepaskan ke aliran darah. Prekursor osteoklas yang terdapat pada sirkulasi darah akan meninggalkan pembuluh darah perifer menuju daerah tulang yang akan diresorpsi, dan berfusi satu sama lain membentuk osteoklas imatur.19. Diferensiasi dari osteoklas imatur menjadi matur memerlukan adanya molekul RANKL. Protein diekspresikan oleh sel stromal osteoblas, limfosit T, dan sel dendritik.RANKL akan berikatan dengan reseptornya, yaitu receptor activator of nuclear factor κB (RANK) yang terdapat pada membran sel prekursor osteoklas. Ikatan antara RANK dengan ligannya akan menyebabkan terjadi transduksi sinyal pada prekursor osteoklas berupa perekrutan protein adaptor tumor necrosis factor receptor associated factor-6 (TRAF 6) sebagai second messenger. Hal tersebut akan mengaktifkan faktor transkripsi nuclear factor κB dan akan bertranslokasi ke nukleus. Nuclear factor κB akan meningkatkan ekspresi c-fos oleh nukleus.
c-fos akan berinteraksi dengan nuclear factor of activated T cells, calcineurin dependent 1(NFAt-c1) yang kemudian akan merangsang transkripsi dari gen yang berperan dalam osteoklastogenesis, sehingga prekursor osteoklas dapat berdiferensiasi menjadi osteoklas matang.18 Setelah osteoklas menjadi matang, aktivitas resorpsi dan survival dari sel tersebut tetap diatur oleh RANKL.19 Proses osteoklastogenesis dihambat oleh molekul OPG yang diekspresikan oleh osteoblas. OPG berikatan dengan RANKL, sehingga RANKL tidak berikatan dengan RANK pada prekursor osteoklas. Akibatnya prekursor osteoklas gagal berdiferensiasi menjadi osteoklas yang matur dan akan diinduksi untuk mengalami kematian sel yang terprogram (apoptosis).18,19.
2.9 Sistem OPG -RANK, dan RANKL 2.9.1 OPG (Osteoprotegerin)
Adalah protein yang berasal dari sel stroma berfungsi mengikat RANKL dan mengganggu obligasi pada RANK. Nama lainnya adalah OCIF (Osteoclastogenesis Inhibiting Factor). Protein ini menghambat diferensiasi menjadi osteoblas, menampilkan hipokalsemi dan menghambat resorpsi.20 OPG ditemukan dalam organ paru-paru, jantung , hati ginjal, timus, kelenjar getah bening, dan sintesis oleh beberapa sel termasuk sel-sel stroma, osteoblas, sel otot polos pembuluh darah, limfosit B, limfosit T, serta kondrosit artikular .20
OPG diproduksi sebagai proprotein dari 401 asam amino dan mengalami suatu intracellular pembelahan menghasilkan 380 asam amino protein matur.21 OPG di produksi oleh sel-sel spesifik dimodulasi oleh beberapa sitokin, vitamin, estrogen dan molekul lain, modulasi osteoklastogenesis dan resorption tulang. OPG diproduksi oleh 1α, 25-dihydroxy vitamin D3, estrogen, pro-inflamasi sitokin seperti interleukin-1 (IL-1) dan TNF-α serta mentransformasikan growth factor-β (TGF-β), sedangkan paratiroid hormon (PTH) dan glukokortikoid menghambat produksi OPG.20 Selain itu, OPG dapat menghambat aktivitas osteoklas, dengan cara berikatan langsung pada RANKL, melalui interaksi dengan reseptor masih dalam tahap awal pembentukan osteoklas.20 Efek biologis dari OPG pada sel tulang sebagai penghambatan, tahap terminal dari diferensiasi osteoklas, penekanan aktivasi osteoklas dewasa dan apoptosis sel osteoklas.20,21.
18
Universitas Indonesia 2.9.2 RANK
RANK (Reseptor Aktivator faktor Nuklir Kappa B) adalah ; protein dalam membran sel osteoklas dan sel dendritik, yang berperan penting bagi semua hormon kalsiumtropik dan proresorpsi sitokin dalam meningkatkan kalsemia dan multifikasi dari osteoklas dalam tulang.22 RANK dianggap sebagai reseptor permukaan hematopoietik mengendalikan osteoklastogenesis dalam metabolisme kalsium. RANK, disintesis sebagai tipe I transmembran protein dari 616 asam amino dan merakit dirinya menjadi fungsional.23 RANK dianggap sebagai reseptor alami RANKL yang terdapat pada; timus, hati , usus besar, kelenjar payudara, prostat, pankreas, dan sel line dari monosit / makrofag termasuk prekursor osteoklas dewasa, limfosit B dan T, sel dendritik, fibroblas, dan artikular kondrosit.24.
2.9.3 RANKL(Reseptor Aktivator faktor Nuklir Kappa B ligand )
Dikenal juga sebagai TRANCE (TNF- related activation-induced cytokine) (Wong dkk., 1997),ODF(osteoclast differentiation factor) (Yasuda dkk., 1998), and OPGL (osteoprotegerin ligand) (Lacey dkk., 1998).25 RANK ligan adalah protein yang diproduksi oleh osteoblas, sel-sel stroma tulang dan diaktifasi oleh sel limfosit B dan T. RANKL berasal dari superfamili TNF dan sintesis sebagai protein matang dari 317 asam amino.26 RANKL sebagian besar terdapat dalam tulang, sumsum tulang dan jaringan limfoid. Peran dominan RANKL dalam fisiologi tulang adalah stimulasi diferensiasi osteoklas / aktivasi dan inhibisi osteoklas apoptosis. Dapat mempromosikan osteoresorpsi oleh induksi ekspresi gen kathepsin K. Selain itu, sitokin berkaitan dengan makrofag faktor stimulasi koloni (M-CSF) juga terlibat dalam proses osteoklastogenesis. 27.
2.10. RANK , RANKL, dan OPG pada Ameloblastoma.
Ameloblastoma merupakan tumor yang berlokasi di tulang, dan dapat terus berlanjut hingga menembus ke jaringan lunak. Untuk berkembang di dalam tulang ameloblastoma harus memiliki mekanisme resorpsi. Namun bagaimana mekanisme resorpsi itu terjadi hingga saat ini masih sangat kurang dipahami. Mekanisme ameloblastoma tumbuh membesar dan menginvasi terlihat pada ekspresi TNF-α, protein anti apoptotik (Bcl-2,Bcl-XL), dan protein interfase (faktor pertumbuhan fibroblas [ FGF], matriks metaloprotein [ MMP], ameloblastoma mengalami proliperasi terlihat dalam siklus sel yang berhubungan dalam Ki-67. Mutasi gen p 53 tidak terlihat pada perkembangan atau pertumbuhan amelolastoma.2
Penelitian Ferry Sandra dkk (2005) mekanisme RANKL dan TNF-α diekspresikan dalam sel-sel ameloblastoma, hal ini dibuktikan dengan adanya proses osteoklastogenesis dimana dapat menghasilkan ruangan pada tulang akibat dari ekspansi ameloblastoma itu sendiri.7 OPG secara bermakna menghambat ameloblastoma dalam osteoklastogenesis secara tidak langsung OPG dapat digunakan sebagai reseptor penghambat proses pertumbuhan ameloblastoma.28 Osteoklas multinuklear berasal dari prekursor hematopoietik dari sel line monosit / makrofag, dan sel stroma dalam sumsum tulang dan osteoblas memodulasi diferensiasi osteoklas melalui molekul yang disekresikan langsung dan melalui interaksi sel ke sel, dan Jalur sinyal melibatkan reseptor diaktifkan faktor nuklear ĸB (RANK) dan ligan (RANKL) memainkan peran utama dalam mengendalikan osteoklastogenesis.29 RANKL, diekspresikan pada membran plasma sel stroma dan osteoblastik mengikat RANK diekspresikan pada membrane plasma asal osteoklas untuk menginduksi jalur sinyal yang menyebabkan diferensiasi dan fusi dari sel prekursor osteoklas dan mempromosikan kelangsungan hidup dan aktivitas osteoklas dewasa. Osteoblas yang disekresikan sebagai penghambat RANKL disebut osteoprotegerin berfungsi menghalangi interaksi antara RANKL dan RANK sehingga menghalangi pembentukan osteoklas.30.
20
Universitas Indonesia 2.11. Imunohistokimia
Imunohistokimia merupakan proses dalam mendeteksi antigen pada sel dari jaringan dengan prinsip reaksi antibodi yang berikatan terhadap antigen pada jaringan. Imunohistokimia seringkali digunakan untuk mengukur dan mengidentifikasi karakteristik dari proses proliferasi sel, apoptosis sel. Imunohistokimia juga sering digunakan untuk penelitian dasar dalam rangka mengetahui distribusi dan lokasi biomarker ataupun protein terekspresi pada berbagai macam jaringan pada tubuh. Untuk memvisualisasikan hasil interaksi antara antigen dan antibodi dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, dimana cara yang paling sering digunakan ialah dengan konjugasi antibodi dengan enzim seperti peroksidase. 31
Antibodi poliklonal
Antibodi poliklonal diproduksi dengan imunisasi hewan yang cocok, biasanya mamalia. Antigen disuntikkan ke binatang, Ig G spesifik untuk antigen ini diproduksi oleh limfosit B sebagai respon imun, dan ini adalah imunoglobulin dimurnikan dari serum hewan. Antibodi diproduksi oleh metode ini berasal dari berbagai jenis sel kekebalan tubuh, dan karenanya disebut poliklonal. 32
Antibodi monoklonal
Antibodi monoklonal berasal dari garis sel tunggal (juga disebut sebagai klon). Dalam teknologi antibodi monoklonal, sel tumor yang dapat mereplikasi tanpa henti menyatu dengan sel mamalia yang menghasilkan antibodi. Hasil fusi sel disebut "hibridoma", yang akan terus memproduksi antibodi. Antibodi monoklonal adalah identik karena diproduksi oleh sel imun yang semuanya adalah klon dari sel induk tunggal. Produksi antibodi monoklonal memerlukan imunisasi hewan, biasanya tikus, mendapatkan sel-sel imun dari limpa. 32
Metode imunohistokimia, dapat dilakukan dengan metode Direct / langsung maupun Metode Indirect / tidak langsung. Dimana keduanya ditentukan oleh prinsip reaksi antibodi yang digunakan, yakni:
Metode Direct / langsung
Metode imunohistokimia direct menggunakan antibodi primer yang sudah terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target secara langsung.
Metode Indirect / tidak langsung
Metode imunohistokimia indirect menggunakan antibodi primer yang tidak ada labelnya, namun digunakan juga antibodi sekunder yang sudah memiliki label dan akan bereaksi dengan IgG dari antibodi primer. 32
2.11.1. Imunohistokimia Metode Da Silva
Untuk imunohistokimia , jaringan potong di 3 µM dan dikumpulkan dalam serial di slide kaca dilapisi dengan 2% 3-aminopropyltriethylsilane (Sigma Kimia, St Louis, MO) yang deparafinasi dan dehidrasi. Bagian itu kemudian diinkubasi dengan hidrogen peroksida 3% dan direndam dalam bufer sitrat, pH 6,0, selama 20 menit pada 95 ° C Bagian itu kemudian diblokir oleh inkubasi dengan serum kambing 3% normal pada suhu kamar, selama 20 menit, dan slide diinkubasi dengan antibodi poliklonal kelinci anti-OPG (H-249, sc11383, Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA ) diencerkan 1:200, anti-RANK (H-300, sc9072, Santa Cruz Bioteknologi) diencerkan 1:200,dan anti-RANKL (FL-327, sc9073, Santa Cruz Bioteknologi) diencerkan 1:150; pada 4 ° C, semalam , dalam ruang lembab. Setelah mencuci di TBS (tris-buffered saline), bagian diobati dengan streptavidin-biotin berlabel kit (K0492, Dako, Carpinteria, CA). Bagian tersebut kemudian diinkubasi dalam 3,3 - diaminobenzidin (K3468, Dako) selama 2 sampai 5 menit dan diwarnai dengan hematoxylin Mayer. Giant cell granuloma digunakan sebagai kontrol positif untuk semua penanda. Kontrol negatif diperoleh oleh kelalaian antibodi primer dan penggantian antibodi primer dengan serum kelinci nonimun (X0902, Dako). 7.
2.11.2. Imunohistokimia Metode Nonaka
Sampel di deparafinisasi dan diberi cairan emersi 3 % hidrogen perosida. Selanjutnya dicuci dengan PBS (Phosphate-buffered saline). Setelah dilakukan perendaman dalam normal serum, selanjutnya inkubasi dengan antibodi primer
22
Universitas Indonesia dalamsuhu kamar. Kemudian dilakukan pencucian sebanyak dua kali dengan PBS, dan dilakukan pelabelan dengan kompleks streptevidin biotin (LSAB + system HRP; dako,Carpinteria, CA) dalam suhu ruangan guna mengikat antibodi primer. Aktivitas peroksida yang terlihat berwarna coklat (cairan DAB +; Dako, Carpentirea, CA). Selanjutnya dilakukan pewarnaan dengan Mayer’s haematosilin. Positif kontrol dengan mengunakan Giant cell tumor untuk RANKL, dan OPG, dan hemangioma kapiler digunakan sebagai positif kontrol untuk CD34 dan α-SMA. 33.
Pada penelitian ini digunakan metode langsung/ direct, dengan antibodi polyklonal yang dipilih guna mendapatkan spesifitas untuk epitop tunggal sehingga bersifat lebih spesifik terhadap antigen target. Sedangkan negatif kontrol dengan antibodi primer dan penganti antibodi primer dengan nonimun serum kelinci. Antibodi primer akan di tempatkan pada antigen yang diinginkan, sedangkan antibodi sekunder akan di tempatkan pada immonoglobulin dari spesies antibodi primer.
2.12 Kerangka Teori
TNF-α (RANKL dan OPG)
Gambar 2.12. Skema kerangka teori penelitian. Epitel Malasez
Selubung Hertwig Epitel kista Dentigerous
- Akantomatosa - Granuler - Basal - Desmoplastik Unikistik Multikistik Ameloblastoma - Matriks Metaloprotein [ MMP-9,2], - Cathepsin K
- Faktor pertumbuhan (IL-1,IL-6,...) - Hormon
- Sitokin
- Protein anti apoptotik (Bcl-2,Bcl-XL)
- Protein interfase (faktor
pertumbuhan fibroblas [ FGF] Periferal Osteoklas matur t Resorpsi tulang Invasif lokal OPG = RANKL Apoptosis OPG ↑ RANKL ↓ Anti apoptosis OPG ↓ RANKL ↑
TNF-α (RANKL dan OPG) - Folikular - Pleksiform -Tipe Campuran
24
Universitas Indonesia BAB 3
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS
3.1 Kerangka Konsep
Gambar 3.1. Kerangka Konsep Penelitian
3.2 Hipotesis
1. Terdapat perbedaan nilai ekspresi OPG pada ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran.
2. Terdapat perbedaan nilai ekspresi RANKL pada ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran .
3. Terdapat perbedaan perbandingan ekspresi RANKL/OPG pada
ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran.
4. Terdapat perbedaan rerata nilai ekspresi OPG pada penderita ameloblastoma di usia < 30 tahun, dengan usia > 30 tahun.
5. Terdapat perbedaan rerata nilai ekspresi RANKL pada penderita ameloblastoma di usia kurang atau sama dengan 30 tahun, dengan usia diatas 30 tahun - Tipe Pleksiform - Tipe Campuran - Tipe Follikular Evaluasi Ameloblastoma Multikistik Ekspresi : RANKL & OPG
- Imu
nopositif
Usia > 30 Usia ≤ 30
OPG = RANKL
4.1. Desain Penelitian
Desain pada penelitian ini adalah studi retrospektif analitik pada penderita ameloblastoma di RSCM periode Januari 2008 – Agustus 2012.
4.2. Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Departemen Patologik Anatomi FKUI / RSUPN Dr. Cipto Mangunkusumo, dalam jangka waktu 7 bulan terhitung mulai awal bulan Mei 2012 sampai dengan akhir November 2012.
4.3. Sampel Penelitian
Populasi penelitian adalah blok parafin pasien ameloblastoma Poliklinik Bedah Mulut RSCM yang tersimpan di Departemen Patologi Anatomik FKUI/RSCM. Pemilihan sampel dilakukan secara consecutive sampling sesuai dengan kriteria inklusi. Besar sampel ditentukan melalui rumus Pagano dan Gauvreau 1993.
n =
(
Z
1-α)
2 σ2 d 2Z
1-α = Standar normal variate ( = 1,96 untuk α = 5 %) α = 5 % ( taksiran confidence interval CI = 1- α = 95 %) σ = Standar deviasi dari rata-rata nilai observed atau expected d = toleransi terhadap kesalahan maksimum spesifik.Misalkan standar deviasi dalam persentasi sel tumor ameloblastoma yang terwarnai adalah 30 % dan toleransi terhadap kesalahan maksimum spesifik ± 10 % dari sel yang ada. Maka, ukuran sampel yang diangap mencukupi untuk menunjukan nilai rata-rata dari persentasi sel-sel yang terwarnai adalah n= 1,962 x 0,32 / 0,12 = 34,57 jadi paling sedikit dibutuhkan 35 sampel.
26
Universitas Indonesia 4.4. Alur Penelitian
Gambar 4.1. Alur penelitian Pengumpulan data pasien Blok parafin ameloblastoma
Pemotongan blok parafin
Pemeriksaan imunohistokimia RANKL dan OPG
Tipe folikular Tipe pleksiform Tipe campuran
Laporan penelitian Analisa data > 30 th
Penilaian ekspresi RANKLdan OPGmengunakan sistem skor > 30 th > 30 th
4.5 Kriteria inklusi
1. Blok parafin ameloblastoma dari pasien berusia 0 - 60 tahun di RSCM , dengan umur sediaan /preparat 1 minggu sampai lima tahun.
2. Sampel ameloblastoma multikistik/solid
3. Sampel ameloblastoma lokasi pada rahang bawah.
4. Sampel pasca operasi diambil bagian lapisan terluar kapsul ameloblastoma 5. Sampel dari jenis kelamin pria dan wanita.
4.6 Kriteria eksklusi
1. Sample yang tidak lengkap keterangan identitas pasien. 2. Sampel operasi rekuren, dan biopsi.
3. Sampel blok parafin yang rusak. 4.7. Variabel Penelitian
4.7.1 Variabel bebas : 1. Ekspresi RANKL. 2. Ekspresi OPG. 4.7.2 Variabel terikat:
1. Preparat ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran.
2. Usia pasien.
4.7.3 Variabel terkendali : 1. Pewarnaan Hematoksilin. 2. Pemotongan blok parafin. 3. Pemulasan Imunohistokimia.
28 Universitas Indonesia 4.8 Definisi Operasional A. Variabel bebas
Variabel Batasan Operasional Cara pengukuran Skala
Ekspresi RANKL
Ekspresi OPG
Ekspresi immunostaining RANKL didapat dengan cara kuantitatif dari blok parafin yang telah dilakukan pemotongan 4 µ kemudian setelah di IHK diperiksa oleh peneliti di dampingi oleh dokter Spesialis Patologi
Anatomi, dengan mengunakan mikroskop cahaya (Olympus BX41 buatan Jepang), dengan pembesaran 100x
Ekspresi immunostaining OPG didapat dengan cara kuantitatif dari blok parafin yang telah dilakukan pemotongan 4 µ kemudian setelah di IHK diperiksa oleh peneliti di dampingi oleh dokter Spesialis Patologi
Anatomi, dengan mengunakan mikroskop cahaya (Olympus BX41 buatan Jepang), dengan pembesaran 100x
Sel yang imunopositif dinilai dengan skor sebagai berikut (P) : 1 = ≤ 10 %, 2 = 11-50 %, 3= 51-100 %, Intensitas staining dinilai dengan skor (I) : 1 = lemah, 2 = moderat, 3 = positif
kuat.Imunoskor RANKL
dihitung dengan mengalikan skor (P) dan skor (I) dengan klasifikasi sebagai berikut :1,2,dan 3 = positif lemah (+), 4 dan 6 = positif sedang (++), 8,9 = positif kuat (+++).
Sel imunopositif dinilai dengan skor (P) : 1 = ≤ 10 %, 2 = 11-50 %, 3 = 51-100 %,
Intensitas staining dinilai dengan (I) : 1 = lemah, 2 = moderat, 3 = positif kuat.
Imunoskor OPG dihitung
dengan mengalikan(P) dan skor (I) dengan klasifikasi sebagai berikut : nilai 1,2,dan 3 = positif lemah (+), nilai 4 dan 6 = positif moderat (++).nilai 8,9= positif kuat (+++).
Ordinal
B. Variabel terikat
Variabel Batasan operasional
Cara pengukuran Skala Blok parafin ameloblastoma /Preparat sampel
Adalah sedian berupa blok parafin ameloblastoma yang telah dipilih menjadi sampel dilakukan pemotongan serial blok parafinnya dengan ketebalan 4-6 µm, dipilih sayatan yang terbaik masing-masing sebanyak 3 buah untuk prosedur immunostaining guna mendeteksi ekspresi RANKL, dan OPG serta satu sayatan untuk kontrol negatif.
Ameloblastoma dalam penelitian ini adalah yang diperoleh di Lab PA FKUI-RSCM yang dalam kesimpulan PA terlabel sebagai ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform ,dan tipe campuran
Tidak diukur
Nominal
Usia Adalah; Umur pasien berdasarkan umur kronologis dimana perhitungan usia yang dimulai dari saat kelahiran seseorang sampai dengan waktu datang. Dibagi dua bagian, usia < 30 tahun dan usia > 30 tahun.
Mengurangi jumlah tahun pasien datang ke klinik dengan tahun kelahirannya. Ratio
Jenis kelamin Adalah jenis kelamin yang
ditetapkan atas dasar morfologi genitalia eksterna. Dikelompokan menjadi laki-laki dan perempuan
30
Universitas Indonesia 4.9 Bahan dan Alat penelitian
Alat – alat penelitian
Kaca preparat (Biogear, 156 buah)
Mikrotom ( Finesse ME +, Thermo Scientific) Slides box (neuralstainkit)
Kaca penutup
Slides warmer (Premiere XH 2001) Staining rack
Staining jar
Microwave (Electrolux) Pipet mikro (Eppendorf) Moist block
Tabung reaksi (18 x 150 mm) Pen parafin (Biogear)
Mikroskop (Olympus BX41) Komputer merk Accer Bahan-bahan penelitian :
Blok parafin ameloblastoma (tipe folikular, tipe pleksiformis, tipe campuran)
Hematoksilin Xylol I,II,III
Alkohol absolut, 96 %,dan 80 %. Metanol
Aqua bidestilata
Hidrogen peroksida 0,5 % Tris EDTA 0,01 M pH 9,0
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7,4 Sniper block (Biocare medical)
Universal link (Biocare medical) Goat serum (Biocare medical)
Antibodi RANKL ( FL-327) polyklonal tikus (Santa Cruz) Antibodi OPG (H-249) polyklonal tikus (Santa Cruz)
Trekavidin HRP (Biocare medical) DAB chromogen kit (Biocare medical) Lithium carbonat
4.10 Prosedur Kerja Prosedur imunostaining:
1. Sampel tumor difiksasi dalam 10 % buffered formalin dan ditanam dalam parafin. Selanjutnya sayatan yang representatif dari setiap sampel tumor dipilih untuk prosedur immunostaining. Masing-masing sayatan akan dipulas dengan metode streptavidin secara imunoperoksidase.
2. Dilakukan pemotongan serial blok parafinnya dengan ketebalan 4-6 µm, dipilih sayatan yang terbaik masing-masing sebanyak 3 buah untuk prosedur immunostaining guna mendeteksi ekspresi RANKL, dan OPG serta satu sayatan untuk kontrol negatif.
3. Dilakukan deparafinisasi dan rehidrasi dengan xylene dan rehidrasi alkohol yang konsentrasinya ( alkohol 96 %, alkohol 80 %, alkohol 70 %). Untuk tujuan memblokir aktifitas endogenous peroksidase sediaan diinkubasi dengan 2 blocking reagen secara terpisah 0,5 % H2O2 dalam metanol selama 30 menit pada suhu kamar kemudian dicuci dalam air, dan inkubasi dalam 3 % NHS selama 20 menit, masing-masing diikuti pencucian beberapa kali dalam PBS, pH 7,4. Kegunaan blocking ini untuk mengurangi reaksi non spesifik.
4. Untuk menampilkan antigen yang optimal (antigen retrieval), specimen dipanaskan dengan mengunakan microwave dalam citrate buffer selama 5 menit power level tinggi dan 10 menit power level rendah, selanjutnya didiaamkan dalam suhu kamar selama 45 menit. Selanjutnya dilakukan pencucian dalam PBS sebanyak 2 kali.
5. Selanjutnya spesimen diinkubasi semalaman dalam antibodi primer Anti-RANKL (FL-327) ( kelinci polyklonal, Santa Cruz. California, dengan pengenceran 1 : 200), dan OPG (H-249) (kelinci polyklonal, Santa Cruz. California, dengan pengenceran 1:200), masing-masing untuk menditeksi ekspresi RANKL dan OPG. Kontrol negatif diinkubasi dengan NHS 3 %.
32
Universitas Indonesia Dilakukan pencucian dengan PBS sebanyak 2 kali dan inkubasi dalam antibody sekunder .
6. Sesudah pencucian dengan PBS, specimen di label dengan cara inkubasinya dalam peroxidase conjugated Streptavidin (Pierce, Australia) selama 30 menit, dan dicuci lagi dalam PBS.
7. Staining dilakukan dengan cara melakukan inkubasi dalam chromogen DAB solution (25mg diaminobenzene tetrahydrochloride dalam 50 ml buffer Tris HCL, pH 7,4 ) selama 5 menit. Selanjutnya dilakukan pewarnaan tanding ( counter staining ) dengan Mayer hematoxylin. Sebelum dilakukan mounting dengan entelan, sediaan didehidrasi dalam alkohol bertingkat (alkohol absolut 80 %, alkohol absolut 96 %, ,). 8. Dari sediaan yang telah terpulas akan dilakukan evaluasi pewarnaan dan
penghitungan jumlah sel yang positif.
9. Sampel yang sudah di IHK kemudian dibagi menjadi 3 kelompok sesuai dengan tipe histopatologiknya, yaitu tipe folikular, tipe pleksiform, tipe campuran. Masing-masing kelompok dibagi lagi sesuai dengan kelompok usia, yaitu < 30 tahun dan > 30 tahun. Preparat diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100 x dan tingkat ekspresi RANKL dan OPG dari masing-masing kelompok dinilai dengan mengunakan sistem skor modifikasi dari skor Nonaka et al. (2008).33.
Presentase sel-sel imunopositif (P): 1 = ≤ 10 %
2 = 11-50 % 3= 51%-100%
Intensitas staining dinilai dengan skor (I) 1 = negatif/lemah
2 = moderat 3 = positif kuat.
Imunoskor RANKL dan OPG dihitung dengan mengalikan skor
presentase skor (P) dan skor intensitas (I) dengan klasifikasi sebagai berikut:
P (%) X I (sel positif) = Skor Imunoekspresi (% sel positif). 1,2, dan 3= skor positif (+) lemah
4, dan 6 = skor positif (++) sedang 8, dan 9= skor positif (+++) kuat 4.11 Manajemen Data dan Analisis Data
4.11.1 Pengolahan Data
Data yang dikumpulkan dimasukan dalam program. 4.11.2 Analisa Data
Mengunakan uji non – parametrik Chi-square dengan p < 0,05. 4.12 Etik Penelitian
Penelitian ini akan diajukan ethical clearance pada Komisi Etik Penelitian Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Indonesia dengan Surat Keterangan Lolos Etik nomor 140/Ethical Clearance/FKGUI/IX/2012.
34
Universitas Indonesia BAB 5
HASIL
Sampel pada penelitian ini diambil dari blok parafin ameloblastoma yang berasal dari lab Patologi Anatomi FK UI – RSCM periode Januari 2008- Agustus 2012. Sampel dipilih melalui consecutive sampling sesuai dengan kriteria inklusi dan eklusi didapatkan jumlah sampel keseluruhan sebanyak 40 sampel. Penelitian ini dilakukan dengan tujuan menganalisis invasif lokal ameloblastoma melalui ekspresi RANKL dan ekspresi OPG pada ameloblastoma tipe folikular, tipe pleksiform, dan tipe campuran. Kemudian menganalisis ratio imunoekspresi RANKL dan Imunoekspresi OPG dengan perbandingan RANKL > OPG , RANKL < OPG , dan RANKL =. OPG, serta menganalisis perbandingan imunoekspresi RANKL dan Imunoekspresi OPG pada sampel ameloblastoma usia < 30 tahun dengan usia > 30 tahun.
5.1 Distribusi sampel penelitian
Sebanyak 40 sampel yang didapat, terdapat sebanyak 13 sampel (32,5 %) berjenis kelamin perempuan dan sebanyak 27 sampel (67,5%) berjenis kelamin laki-laki (Tabel 5.1) , dengan rasio perbandingan 1 : 2,07. Besar jarak usia sampel penelitian 12 – 59 tahun dengan usia rata – rata 37,5 tahun. Sampel dengan usia sama dengan 30 tahun kebawah adalah sebanyak 13 sampel (32,5%), dan usia diatas 30 tahun sebanyak 27 sampel ( 67,5 %) lihat (Tabel 5.2). Dari data jenis histopatologi ameloblastoma didapatkan jenis pleksiformis sebanyak 9 sampel (22,5 %), jenis folikuler sebanyak 15 sampel (37,5%), dan jenis campuran sebanyak 16 sampel (40 %) (Tabel 5.3).
Tabel 5.1 Distribusi sampel berdasarkan jenis kelamin.
Jenis kelamin Jumlah Presentasi (%)
Laki –laki 27 67,5 %
Perempuan 13 32,5%
Tabel 5.2 Distribusi sampel berdasarkan usia
Usia Jumlah Persentase (%)
< 30 tahun 13 32.5
>30 tahun 27 67.5
Total 40 100.0
Tabel 5.3 Distrbusi sampel berdasarkan jenis histopatologis ameloblastoma
5.2 Ekspresi RANKL (Reseptor Aktivator faktor Nuklir Kappa B ligand ) dan OPG (Osteoprotegerin) pada ameloblastoma tipe pleksiform,
tipe folikular, dan tipe campuran.
Hasil pemulasan imunohistokimia antibodi RANKL dan antibodi OPG diamati dibawah mikroskop cahaya dan ekspresi keduanya dinilai berdasarkan presentasi sel-sel yang imunopositif dan intensitas ekspresinya pada tiap-tiap kelompok kemudian dilakukan pengkalian kedua nilai tersebut sehingga didapatkan skor nilai ekspresi RANKL dan skor nilai ekspresi OPG. Untuk mendapatkan skor imunohistokimia ekspresi RANKL dan skor imunohistokimia ekspresi OPG pada ameloblastoma tipe pleksiform, tipe folikular, dan tipe campuran digunakan analisa statistik uji Chi-square dengan batas kemaknaan p < 0,05.
Jenis histopatologis Jumlah Presentasi (%)
Tipe Folikular 15 37,5 %
Tipe Pleksiform 9 22,5 %
Tipe Campuran 16 40,0 %
