BAB 1 PENDAHULUAN
2.6. Uji Reaksi Biokimia
Pengamatan aktivitas biokimia atau metabolisme mikroorganisme yang diketahui dari kemampuan mikroorganisme untuk menggunakan dan menguraikan molekul yang kompleks seperti karbohidrat, lemak, protein, dan asam nukleat.
Selain itu dilakukan pula pengamatan pada molekul-molekul sederhana seperti asam amino dan monosakarida. Dan hasil dari berbagai uji ini digunakan untuk perincian dan identifikasi mikroorganisme. Penggunaan zat hara tergantung dari aktivitas metabolisme mikroba (Maisyah, 2009)
Uji katalase merupakan suatu pengujian terhadap bakteri tertentu untuk mengetahui apakah bakteri tersebut merupakan bakteri aerob, anaerob fakultatif, atau anaerob obligat. Bakteri yang memerlukan oksigen menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2) yang sebenarnya beracun bagi bakteri sendiri. Namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolit tersebut karena mereka menghasilkan enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen (Volk and Wheeler, 1993)
Bakteri memiliki berbagai aktivitas biokimia dengan menggunakan raw material yang diperoleh dari lingkungan sekitarnya. Transformasi biokimia dapat timbul di dalam dan di luar dari bakteri yang di atur oleh katalis biologis yang
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
15
dikenal sebagai enzim. Setiap bakteri memiliki kemampuan dalam menggunakan enzim yang dimilikinya untuk degradasi karbohidrat, lemak, protein, dan asam amino. Metabolisme atau penggunaan dari molekul organik ini biasanya menghasilkan produk yang dapat digunakan untuk identifikasi dan karakterisasi bakteri (Maisyah, 2009).
E. coli adalah suatu bakteri gram negatif berbentuk batang, bersifat anaerob fakultatif dan mempunyai flagella peritrikat. E. coli dibedakan atas sifat serologinya berdasarkan antigen O (somatik), K (kapsul), dan H (flagella). Media selektif yang dapat digunakan untuk mengisolasi E. coli misalnya DHL (Desoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose) Agar atau MacConkey Agar. Koloni E. coli pada DHL dan MacConkey Agar berwarna merah dan keliling oleh areal yang menunjukkan pengendapan bile E. coli akan memfermentasi laktosa di dalam media menjadi asam. Sehingga mengakibatkan terjadinya pengendapan bile dan penyerapan indikator merah netral (Waluyo, 2004)
Uji-uji biokimia yang dilakukan terhadap E. coli termasuk karakteristik pertumbuhan pada Agar TSI (Tripel Sugar Iron) dan Agar SIM (Sulfite Indole Motility) atau LIM (Lysine Indole Motility). Uji-uji biokimia ditujukan untuk menunjukkan E. coli dan bakteri-bakteri lainnya yang mempunyai sifat hampir sama, yaitu Klebsiella dan Enterobacter. Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan CO2 dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar (Guli, 2011)
Berikut beberapa uji Biokimia yang digunakan untuk identifikasi bakteri antara lain:
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
16
Indol
Media ini biasanya digunakan dalam identifikasi yang cepat. Hasil uji indol yang diperoleh karena terbentuk lapisan (cincin) berwarna merah muda pada permukaan biakan, artinya bakteri ini tidak membentuk indol dari tryiptofan sebagia sumber karbon yang dapat ketahui dengan menambahkan larutan kovacs. Asam amino tryiptofan merupakan komponen asam amino yang lazim terdapat pada protein, sehingga asam amino ini dengan mudah dapat digunakan oleh mikroorganisme akibat penguraian protein (Guli, 2011)
MR-VP
- Uji MR
Hasil positif ditandai dengan terjadinya perubahan warna menjadi merah setelah ditambhakan methyl red. Artinya, bakteri ini menghasilkan asam campuran dari proses fermentasi glukosa yang terkandung dalam media MR-VP. Terbentuknya asam campuran pada media akan menurunkan keasaman sampai 5,0 atau kurang, oleh karena itu bila indikator metal ditambahkan pada biakan tersebut dengan nilai keasaman sederhana maka indikator tersebut menjadi merah. Hal ini menandakan bahwa bakteri ini peragi asam campuran (Guli, 2011).
- Uji VP
Hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna merah setelah ditambahkan α-napthol dan KOH, hal ini berarti hasil akhir dari fermentasi bakteri adalah asetil karbinol (asetolin) (Guli, 2011).
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
17
SIM (Sulfite Indole Motility)
Hasil positif pada uji ini ditandai dengan adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar di sekitar inokulat. Hal ini menunjukkan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasikan, yang berarti bahwa bakteri memiliki flagella. Dan akan terlihat adanya warna hitam pada media yang menandakan bahwa bakteri tersebut mrnghasilkan Hidrogen (H2S) (Guli, 2011)
Simmons Citrate
Hasil positif pada uji ini ditandai dengan terjadiya perubahan warna media dari hijau menjadi biru, artinya bakteri mempunyai enzim sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat ke dalam (Guli, 2011)
TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)
Uji ini dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri memfermentasi glukosa, laktosa, dan sukrosa. Hal ini ditandai dengan perubahan warna akibat timbulnya suasana asam, serta terbentuknya H2S yang ditandai dengan perubahan warna media dari orange menjadi hitam, karena bakteri mampu mendesulfurasi asam amino dan metion yang akan menghasilkan H2S, dan H2S akan bereaksi dengan Fe2+ yang terdapat pada media yang menghasilkan endapan hitam. Hasil fermentasi diamati pada 2 tempat, yaitu bagian miring dan bagian dasar (Guli, 2011)
Uji gula-gula
Uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri yang mampu memfermentasi karbohidrat. Larutan gula yang dipakai adalah glukosa,
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
18
laktosa, maltose, manitol, dan sukrosa, ditandai dengan perubahan warna dari biru menjadi kuning (Guli, 2011)
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
19
13. Kompor listrik Q-one
14. Mikroskop A-faith
20
3.2. Bahan
1. Aquadest steril 2. Air kelapa hijau steril 3. Agar-agar
9. Media Simmons Citrate 10. Media SIM
11. Kovac’s
3.3. Prosedur Percobaan
3.3.1 Pembuatan Media
A. Media TSIA (Tripel Sugar Iron Agar) 1. Ditimbang 6,5 gram media TSIA 2. Dilarutkan dalam 100 ml aquadest
3. Dimasak diatas kompor listrik selama 15 menit pada suhu 121ºC 4. Dibagi ke dalam beberapa tabung reaksi dan ditutup dengan kapas
steril
5. Dimiringkan sekitar 45º lalu dibiarkan memadat
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
21
B. Media SIM (Sulfite Indole Motility) Agar 1. Ditimbang 3,6 gram media SIM 2. Dilarutkan dalam 100 ml aquadest
3. Dimasak diatas kompor listrik selama 15 menit pada suhu 121ºC 4. Dibagi ke dalam beberapa tabung reaksi dan ditutup dengan kapas
steril
5. Dibiarkan memadat C. Media Simmons Citrate Agar
1. Ditimbang 2,4 gram media SCA 2. Dilarutkan dalam 100 ml aquadest
3. Dimasak diatas kompor listrik selama 15 menit pada suhu 121ºC 4. Dibagi ke dalam beberapa tabung reaksi dan ditutup dengan kapas
steril
5. Dibiarkan memadat D. Media Air Kelapa Hijau
1. Ditimbang 6,5 gram agar-agar
2. Dilarutkan dalam 100 ml air kelapa hijau
3. Dimasak diatas kompor listrik selama 15 menit pada suhu 121ºC 4. Dibagi ke dalam beberapa tabung reaksi dan ditutup dengan kapas
steril
5. Dibiarkan memadat
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
22
3.3.2 Penanaman Bakteri Escherichia coli
1. Disterilisasi terlebih dahulu tangan dan laminar flow (tempat kerja) menggunakan alkohol 97% dan gunakan sarung tangan dan masker 2. Diinokulasikan biakan E. coli pada permukaan media air kelapa
dengan ose bengkok secara aseptis
3. Diinkubasi dengan inkubator 37ºC selama 48 jam
3.3.3 Uji Reaksi Biokimia
1. Disiapkan biakan E. coli yang telah diinkubasi 2. Diambil 1 ose biakan E. coli dengan jarum ose lurus
3. Diinokulasikan ke dalam media TSIA (ditusukkan vertikal), SIM (ditusukkan vertikal), dan Simmons Citrate (digoreskan pada permukaan media) dengan menggunakan jarum ose lurus
4. Diinkubasi dengan inkubator 37ºC selama 48 jam 5. Diamati apa yang terjadi
3.3.4 Pewarnaan Gram
1. Disediakan objek glass steril dan bebas lemak 2. Diteteskan aquadest steril pada objek glass
3. Diinokulasikan 1 ose koloni dengan jarum ose cincin dan disebarkan pada objek glass secara merata
4. Diteteskan larutan indol (Kristal violet) merata pada objek glass 5. Diamkan selama 5 menit, lalu cuci dengan aquadest
6. Diteteskan larutan lugol merata pada objek glass
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
23
7. Diamkan selama 3 menit, lalu cuci dengan aquadest 8. Diteteskan alkohol 97% merata pada objek glass 9. Diamkan selama 1 menit, lalu cuci dengan aquadest 10. Diteteskan safranin merata pada objek glass
11. Diamkan selama 2 menit, lalu cuci dengan aquadest
12. Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 40x dan 100x (tambahkan 1 tetes immersion oil pada permukaan objek glass)
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
24
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Data dari pemanfaatan air kelapa hijau (Cocos nucifera) sebagai media pertumbuhan bakteri Escherichia coli pada tanggal 19 Februari 2018 yang dilaksanakan di Balai Laboratorium Kesehatan Daerah adalah sebagai berikut:
Tabel 4.1. Hasil Pengujian Menggunakan Metode Reaksi Biokomia
Media Keadaan Media Setelah Inkubasi Hasil Pengamatan TSIA Media menghitam dan terbentuk H2S Positif SIM Pada inokulat terbentuk seperti serabut putih Positif
SCA Media berubah menjadi biru Positif
Gambar 4.1. Hasil inkubasi bakteri pada uji Reaksi Biokimia
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
25
4.2 Pembahasan
Penelitian ini dilakukan untuk menjadikan air kelapa hijau sebagai media alternatif pertumbuhan bakteri Escherichia coli mengingat harga media instan cukup mahal. Selain bahannya mudah ditemukan, ketersediaannya di alam juga cukup mendukung sehingga sangat tepat untuk dijadikan media alternatif pengganti media instan.
Pada identifikasi E. coli dengan uji reaksi biokimia terjadi perubahan pada media. Untuk TSIA, uji positif ditandai dengan perubahan media dari orange menjadi hitam karena bakteri mampu mendesulfurasi asam amino yang akan menghasilkan H2S, dan H2S akan bereaksi dengan Fe2+ yang terdapat pada media menghasilkan endapan hitam. Untuk SIM, uji positif ditandai dengan adanya penyebaran yang berwarna putih seperti akar di sekitar inokulat. Hal ini menunjukkan adanya pergerakan dari bakteri yang diinokulasi, yang berarti bahwa bakteri memiliki flagella. Untuk SCA, uji positif ditandai dengan terjadinya perubahan warna media dari hijau menjadi biru, artinya bakteri memiliki enzim sitrat permiase yaitu enzim spesifik yang membawa sitrat masuk kedalam.
Identifikasi E. coli dengan pewarnaan gram, dimulai dengan zat pewarna primer (Kristal violet), bakteri gram positif akan menyerap zat warna sedangkan bakteri gram negatif akan melepas zat warna, lalu dilanjutkan dengan mengintensifkan zat warna menggunakan larutan lugol, dicuci dengan alkohol yang kemudian akan menyerap zat warna terakhir yaitu safranin sehingga berwarna merah.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
26
Gambar 4.2. Identifikasi E. coli dengan Pewarnaan Gram
E. coli merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang, bersifat anaerob fakultatif dan mempunyai flagella peritrikat. E. coli debedakan atas sifat serologinya berdasarkan antigen O (somatik), K (kapsul), dan H (flagella).
(Waluyo, 2004)
Pewarnaan gram pertama kali dikembangkan oleh seorang ahli histology Christian Gram (1884). Dengan pewarnaan gram, bakteri dapat dibagi atas 2 golongan yaitu gram positif yang warnanya ungu karena mengikat zat warna utama “Kristal violet” dan gram negatif yang warnanya merah muda karena melepas zat warna utama dan menangkap zat warna penutup “safranin”. (Natsir dan Sartini, 2006)
Bakteri memiliki berbagai aktivitas biokimia menggunakan raw material yang diperoleh dari lingkungan sekitarnya. Transformasi biokimia dapat timbul di dalam dan di luar bakteri yang diatur oleh katalis biologis dikenal sebagai enzim.
Setiap bakteri memiliki kemampuan dalam menggunkan enzim yang dimilikinya umtuk degradari karbohidrat, lemak, protein, dan asam amino. Metabolisme atau pengunnaan dari molekul organik biasanya menghasilkan produk yang dapat digunkan untuk identifikasi dan karakterisasi bakteri. (Maisyah,2009)
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
27
Uji-uji biokimia yang dilakukan terhadap E. coli termasuk karakteristik pertumbuhan pada Agar TSIA dan Agar SIM atau LIM (Lysine Indole Motility).
Uji-uji biokimia ditujukan untuk menunjukkan E. coli dan bakteri-bakteri lainnya yang mempunyai sifat hampir sama, yaitu Klebsiella dan Enterobacter.
Pembentukan gas positif ini hasil dari fermentasi H2 dan CO2 dapat dilihat dari pecahnya dan terangkatnya agar (Guli, 2011)
Uji indol bertujuan mengidentifikasi kemampuan bakteri menghasilkan indol dengan menggunakan enzim tryptophanase. Produksi indol di dalam media dimungkinkan karena adanya tryptophan, menjadi indol , piruvat dan ammonia.
(Hemraj, 2013)
Gambar 4.3. Rantai reaksi uji indol (Hemraj, 2013)
Tryptophan adalah asam amino esensial yang teroksidasi oleh beberapa bakteri yang mengakibatkan pembentukan indol, asam piruvat dan ammonia.
Indol yang dihasilkan dengan menambahkan reagen Kovac’s ini yang menghasilkan cincin berwarna merah (Sridhar, 2006). Hasil uji indol pada isolate bakteri E. coli adalah positif yang ditunjukkan adanya cincin merah pada bagian atas.
Uji sitrat bertujuan mendeteksi kemampuan suatu mikroorganisme untuk memanfaatkan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Pemanfaatan
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
28
sitrat melibatkan enzim citrate permease, yang memecah sitrat menjadi oksaloasetat dan asetat. Oksaloasetat lebih lanjut dipecah menjadi piruvat dan CO2. Produksi Na2CO3 serta NH3 dari pemanfaatan natrium sitrat dan garam amonium masing-masing menghasilkan pH basa. Hal ini menyebabkan perubahan warna medium dari hijau menjadi biru (Hemraj, 2013)
Citrate Oxalocetate + Acetate
Oxalocetate Pyruvate + CO2
CO2 + Na + H2O Na2CO3
Gambar 4.4. Reaksi kimia uji sitrat (Hemraj, 2013)
TSIA agar adalah media diferensial yang digunakan dalam menentukan fermentasi karbohidrat dan produksi H2S. Selain itu, uji TSIA juga dapat mendeteksi adanya gas hasil dari metabolisme karbohidrat. Hasil dari pengamatan uji TSIA pada E. coli menunjukkan hasil A/A dengan gas positif dan H2S negatif.
Warna kuning pada keseluruhan media tersebut dikarenakan E. coli pada TSIA dapat menfermentasikan glukosa, laktosa, dan sukrosa. Gas positif dikarenakan gas yang dihasilkan oleh fermentasi karbohidrat akan muncul sebagai celah dimedia atau akan mengangkat agar dari bagian bawah tabung. (Leboffe, 2011) Media uji motilitas digunakan untuk menentukan motilitas dari suatu mikroorganisme. Hasil pengamatan uji motilitas pada E. coli adalah positif. Hal ini ditunjukkan dengan adanya pertumbuhan bakteri di sekitar area penusukan.
Pergerakan dari bakteri tersebut dikarenakan media semisolid dirancang dengan
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
29
mengurangi konsentrasi agar pada media yaitu sekitar 0,4 % pada media yang hanya cukup untuk mempertahankan bentuknya sementara memungkinkan pergerakan bakteri bergerak. (Leboffe, 2011)
Fermentasi karbohidrat adalah proses metabolisme oleh molekul organik yang bertindak memberikan donor elektron serta satu atau lebih produk organik yang bertindak sebagai penerima elektron. Fermentasi glukosa dimulai dengan memproduksi piruvat. Produk akhir fermentasi piruvat meliputi berbagai asam, alkohol, dan H2 atau gas CO2. Produk akhir yang spesifik tergantung pada organisme tertentu. (Hemraj, 2013)
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
30
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Hasil dari penelitian yang dilakukan bahwa bakteri yang tumbuh pada media air kelapa hijau positif E. coli, karena hasil identifikasi pada pewarnaan gram dan reaksi biokimia menunjukkan ciri yang sama pada karakteristik E. coli.
5.2. Saran
Diharapakan supaya penggunaan media alternatif bakteri seperti air kelapa hijau lebih ditingkatkan pengaplikasiannya agar dapat meminimalisir dana untuk pembuatan media terutama dalam skala industri atau institusi.
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
31
DAFTAR PUSTAKA
Atlas, R.M. 2004. Handbook of Microbiological Media. Third Edition. CRC Press. USA
Cappucino, J.G. 2014. Manual Laboratorium Mikrobiologi. Edisi 8. EGC. Jakarta Direktorat Gizi Depkes RI. 1981. Daftar Komposisi Bahan Makanan. Bratara
Karya Aksara. Jakarta
Ganiswarna, S. 1995. Farmakologi dan Terapi. Edisi IV. UI Press. Jakarta
Guli, M.M. 2011. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Kesehatan. Universitas Tadulako. Palu
Hemraj, V. 2013. A Review on Commonly Used Biochemical Test For Bacteria.Inovare Journal of Life. India
Jawets. 1995. Mikrobiologi Kedokteran. Salemba Medika. Jakarta Kusnadi. 2003. Mikrobiologi, Common Textbook. UPI. Bandung
Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. Rajawali Press. Jakarta Leboffe, M.J. A Photographic Atlas for The Microbiology Laboratory. Morton
Publishing Company. America
Maisyah. 2009. Aktivitas Biokimia Mikroba. Erlangga. Jakarta
Natsir dan Sartini. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Universitas Hasanuddin.
Makasar
Palungkun, R. 2004. Aneka Produk Olahan Kelapa. Swadaya. Bogor Pelczar. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Volume 2, UI Press : Jakarta Ratna, H. 1990. Mikrobiologi Dalam Praktek. Gramedia. Jakarta
Simanihuruk. 2013. Pengolahan Limbah Kelapa. Andi Offset. Yogyakarta
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
32
Sridhar. 2006. IMViC Reaction. JJMMC. United States of America
Suhardiman, P. 1999. Bertanam Kelapa Hibrida. Penebar Swadaya. Jakarta Volk dan Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar. Edisi kelima, Erlangga : Jakarta Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang Press. Malang
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
33
LAMPIRAN
Lampiran 1. Tepung agar-agar yang digunakan
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
34
Lampiran 2. Pereaksi yang digunakan dalam pewarnaan gram
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
35
Lampiran 3. Hasil uji reaksi biokimia dan pengamatan pewarnaan gram
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
36
Lampiran 4. Koloni E. coli pada permukaan media air kelapa setelah di inkubasi
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
37
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA