Penulis dilahirkan di Sukoharjo Propinsi Jawa Tengah pada tanggal 03 September 1980 sebagai anak ketiga dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Sarwo Diharjo dan Ibu Wiji. Pada tahun 1999 penulis lulus dari SMU Negeri I Sukoharjo dan kemudian melanjutkan studi di Jurusan Biologi FMIPA Universitas Sebelas Maret dan lulus pada tahun 2004.
Penulis bekerja sebagai Peneliti Bidang Sumberdaya Laut di Pusat Penelitian Oseanografi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia sejak tahun 2006 hingga sekarang. Tahun 2010 penulis mendapatkan kesempatan untuk belajar di Program Magister Sains pada Program Studi Ilmu Akuakultur Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor melalui Beasiswa dari Kementerian Riset dan Teknologi Republik Indonesia.
Rumput Laut ▼ ◆ ❖ ❖◆❖P◗❘❙■ ◆ ❚❯◆ ❱ ❲❑ ❍❍ Menggunakan Perantara ❳❨❱❏❩◆ ❘❲❱❍❙▲ ❬❙▲❲❭◆❘❍❲❪ ■. Dibimbing oleh ALIMUDDIN dan UTUT WIDYASTUTI.
Penyakit❍❘❲ ❫❍❘❲merupakan salah satu permasalahan besar dalam budidaya rumput laut ▼ ◆ ❖ ❖◆❖P◗❘❙■ ◆❚❯◆❱ ❲❑ ❍❍. Penyakit ini diduga disebabkan oleh infeksi bakteri dan diinduksi oleh perubahan kualitas air secara drastis. Infeksi ❍❘❲ ❫❍❘ ❲ dapat menyebar luas, menyebabkan kerusakan talus hingga mencapai 60-80% dan menyebabkan penurunan produksi. ●❍■ ❏❑ ❍▲ memiliki aktivitas bakterisidal yang mampu menghidrolisa ikatan -1,4-glikosida dari peptidoglikan yaitu antara asam N-asetil glukosamin dan asam N-asetil muramat yang merupakan penyusun dinding sel bakteri Gram positif dan beberapa bakteri Gram negatif.● ❍■ ❏❑ ❍▲ayam telah dilaporkan memiliki aktivitas litik terhadap ❴❍❘❱❏❘❏❘❘❙■ ❚◗■ ❏❵❲❍❛❬❍❘❙■❜ ❝ ❚◆❯❏❩◆❘❬❲❱❍❙▲ ❘❏❚❙▲❪◆ ❱❲ ❜ ❳❲❱❏▲❏ ❪◆■ P◗❵❱❏❖P❍❚❚◆ dan ❞❍❩❱❍❏ ◆❪❨ ❙❍❚❚◆ ❱❙▲. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi plasmid biner pembawa gen ❚❍■ ❏❑ ❍▲ ayam dan mentransformasikan pada talus ▼❡ ◆ ❚❯◆❱ ❲❑ ❍❍ melalui vektor ❳❡ ❬❙▲❲❭◆❘❍❲❪ ■. Konstruksi plasmid biner dilakukan dengan menggunakan pMSH1.
Gen ❚❍■ ❏❑ ❍▲ diamplifikasi dari pJfKer-Lis menggunakan PCR dengan primer spesifik gen ❚❍■ ❏❑ ❍▲ ayam. Plasmid pMSH-1 dan gen❚❍■ ❏❑ ❍▲ produk PCR dipotong dengan enzim ❢ ❏ ❬I dan ❣❖❲I. Gen lisozim diligasi ke dalam vektor ekspresi pMSH1 dan selanjutnya ditransformasi ke ❤■❘ P❲❱❍❘ P❍◆ ❘❏❚❍ DH5 menggunakan kejutan suhu. Plasmid pMSH1-Lis ditransformasi ke❳❡ ❬❙▲❲❭◆ ❘❍❲❪■ LBA4404 melalui ❬❱❍❖◆❱ ❲❪ ❬◆ ❚ ▲◆❬❍❪❨. Sebanyak 225 talus diinokulasikan dengan ❳❡ ❬❙▲❲❭◆❘❍❲❪ ■ yang membawa plasmid pMSH1-Lis di bawah kendali promoter 35S CaMV dan terminator Nos. Kokultivasi berlangsung selama 3 hari pada media PES (✐❱❲ ❯◆■❏❚❍❥■ ❤❪❱❍❘ P❲❵ ❣❲◆ ❦ ◆❬❲❱) yang mengandung 200 mg/L asetosiringon. Talus transforman diseleksi pada media PES yang mengandung 20 mg/L higromisin.
Konstruksi plasmid biner pMSH1 yang mengandung gen ❚❍■ ❏❑ ❍▲ telah berhasil dilakukan dan ditransformasikan ke ❤❡ ❘❏❚❍ DH5 dan ❳❡ ❬❙▲❲❭◆ ❘❍❲❪■ LBA4404. Jumlah talus ▼❡ ◆ ❚❯◆ ❱❲❑ ❍❍ tahan higromisin sebanyak 53 talus atau 23,56% dari jumlah talus yang diinfeksi. Jumlah talus yang bertunas sebanyak 6 talus dengan efisiensi tunas putatif sebesar 11,32%. Analisis molekuler terhadap talus yang tahan higromisin dengan PCR menggunakan kombinasi primer spesifik gen ❚❍■ ❏❑ ❍▲, promoter 35S CaMV dan terminator Nos menunjukkan bahwa 3 tunas yang terbentuk dari 3 talus mengandung gen ❚❍■ ❏❑ ❍▲. Persentase transformasi dalam penelitian ini adalah 23,56%.
Berdasarkan nilai persentase transformasi, maka protokol transformasi masih perlu dimantapkan agar diperoleh transforman dan tunas putatif lebih banyak. Selanjutnya, rumput laut transforman perlu diuji untuk mengevaluasi tingkat toleransinya terhadap infeksi bakteri dan stres lingkungan.
Kata kunci: ▼ ◆ ❖ ❖◆❖P◗❘❙■ ◆❚❯◆❱ ❲❑ ❍❍, ❚❍■ ❏❑ ❍▲, ❳❨ ❱❏❩◆ ❘❬❲❱❍❙▲ ❬❙▲❲❭◆❘❍❲❪ ■❜ transformasi genetik.
Lysozyme Gene in Seaweed r sttst ✉ ✈✇①② s③④ s⑤⑥⑦ ⑧⑧ Using ⑨ ⑩ ⑤❶❷ s ✇❸⑥ ⑤⑧ ①❹ ❸ ① ❹⑥❺s✇⑧⑥❻②-mediated Transfer. Supervised by ALIMUDDIN and UTUT WIDYASTUTI.
Ice-ice disease is the biggest problem in the cultivation of seaweed rst t st✉✈✇①② s③④ s ⑤⑥⑦ ⑧⑧. The disease is caused by bacterial infection and induced by drastic changes of water quality. ❼✈② ❶⑦ ✈❹⑥ has the ability to break down bacterial cell wall. Lysozymes are well-characterized hydrolases, which cleave beta-1,4 linkages of N-acetylglucosamine (GlcNAc) homopolymers and beta-1,4 linkages of the bacterial cell wall component GlcNAc-N-acetylmuramic acid peptidoglycan. Chicken lysozyme had lytic activities against ❽⑧ ✇⑤❶ ✇❶✇✇①② ③✈② ❶❾⑥⑧❿❸⑧ ✇①② ➀ ➁③s④ ❶❷s✇❸⑥ ⑤⑧ ① ❹ ✇❶ ③①❹❻s⑤⑥ ➀ ⑨⑥ ⑤ ❶ ❹❶❻s② ✉ ✈❾ ⑤❶t✉ ⑧ ③③s and ➂⑧❷ ⑤⑧ ❶ s❻⑩ ①⑧ ③③s ⑤① ❹➃ The purpose of this research was to construct of a binary vector pMSH1-Lis carrying chicken③✈② ❶⑦ ✈❹⑥(❼⑧②) gene and introduce pMSH1-Lis onr ➃ s ③④ s⑤⑥⑦ ⑧⑧.
Lysozyme gene was amplified from pJfKer-Lis using PCR with specific primers for chicken lysozyme gene. Plasmid pMSH-1 and PCR product of lysozyme gene was cut with enzymes ➄❶❸I and ➅t⑥I. Lysozyme gene was ligated into the expression vector pMSH1 to design a binary expression vector of pMSH1-Lis. The pMSH1-Lis was transformed to➆② ✇✉ ⑥ ⑤⑧ ✇✉⑧ s ✇❶③⑧ DH5 by heat shock, cultured and then the plasmid was isolated. The binary vector expression was transformed into ⑨ ⑩ ⑤❶❷ s ✇❸⑥ ⑤⑧ ① ❹ ❸ ① ❹⑥❺s✇⑧⑥❻② LBA4404 by tri-parental mating. Thallus was inoculated with⑨➃❸ ①❹⑥❺s✇⑧⑥❻② carrying pMSH1-Lis and then the transformed thallus was selected by adding 20 mg/L hygromycin to the culture medium.
PCR analysis showed that the construction of the binary plasmid pMSH1- Lis was established. Percentage of transformation of pMSH1-Lis onr ➃ s ③④ s⑤⑥⑦ ⑧⑧ was 23.56%, while the efficiency of putative bud was 11.32%. PCR analysis showed that three of the regenerated thallus contained ③✈② ❶⑦ ✈❹⑥ gene. Thus, transgenic r ➃ s③④ s ⑤⑥⑦⑧⑧ was produced successfully and this can be useful for studying the mechanisms of seaweed defense against bacterial infection.
Based on the percentage of the transformation, the transformation protocols need to be established for increasing transformants and regenaration thallus. Test bacterial resistance and environmental stress is necessary to examine the transformants tolerance.
Keywords: Kappaphycus alvarezii, lysozyme, Agrobacterium tumefaciens,genetic transformation
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kappaphycus alvarezii merupakan salah satu jenis rumput laut merah (Rhodophyta) yang banyak dibudidayakan di Indonesia. Sentra produksinya mulai dari Bali, Lombok, Sumbawa, Sumba, Flores, Kupang, Maluku, Sulawesi Selatan, Sulawesi Tenggara, Sulawesi Tengah, Sulawesi Utara, Aceh, Riau, Lampung, Bangka-Belitung, Banten, Kepulauan Seribu, Karimun Jawa, Banyuwangi, dan Madura (Sulistijo 1998). Rumput laut ini merupakan sumber kappa-karaginan yang dimanfaatkan dalam berbagai industri, antara lain: makanan, tekstil, kosmetik, farmasi, dan fotografi (Yu et al. 2002). Kappa-karaginan banyak dimanfaatkan sebagai stabilisator, bahan pengental, pembentuk gel dan pengemulsi (Bixler 1996). Permintaan pasar terhadapK. alvarezii sekitar delapan kali lebih banyak dari jenis lainnya (Sulistijo 2002).
Upaya peningkatan produksi dilakukan dengan memperluas penanaman rumput laut pada daerah pantai yang cocok untuk budidaya dan dengan divertifikasi teknologi budidaya. Namun demikian, serangan penyakit ice-ice merupakan kendala paling merugikan karena sulit ditanggulangi dan waktu penyebarannya relatif cepat. Infeksi ice-ice dapat menyebar luas hanya dalam waktu sekitar satu minggu, dan dapat menyebabkan kerusakan talus hingga mencapai 60-80% dalam waktu 1-2 bulan (Sulistijo 2002). Penyakit ice-ice juga menyebabkan penurunan kandungan karaginan (Amiluddin 2007). Fenomena demikian sangat merugikan bagi pembudidaya, bahkan dapat menyebabkan kebangkrutan dalam usaha budidaya rumput laut (Yulianto dan Mira 2009).
Bakteri yang diduga sebagai agen penyakit ice-ice adalah Pseudomonas nigricaciens, P. fluorescens, Vibrio granii, Bacillus cereus, dan V. agarliquefaciens. Hasil uji patogenitas terhadap kelima bakteri tersebut menunjukkan bahwa patogenitas tertinggi dimiliki oleh V. agarliquefaciens (Nasution 2005). Selain itu, Largo (2002) juga menemukan bakteri Vibrio pada talus yang terserangice-ice. Aris (2011) melaporkan lima jenis bakteri pada talus K. alvarezii yang terserang ice-ice, yaitu Flavobacterium meningosepticum, V. alginoliticus, Pseudomonas cepacia, P. diminuta, dan Plesiomonas shigelloides. Sementara itu, Nurjana (2008) mengidentifikasi bakteri pada rumput laut yang terserang ice-ice, yaitu Chromobacterium, Acinetobacter, Flavocytofaga dan Vibrio.
Rekayasa genetik diketahui dilaporkan dapat digunakan untuk meningkatkan daya tahan organisme budidaya terhadap infeksi bakteri patogen (Yazawa et al. 2006; Burge et al. 2007; Fletcher et al. 2011). Pada rumput laut, penelitian awal terkait pengembangan metode transfromasi dan uji aktivitas promoter telah dilaporkan oleh beberapa peneliti. Huddy et al. (2012) telah berhasil mentransformasi gen LacZ ke dalam talus Gracilaria gracilis menggunakan metode tembakan partikel, demikian juga dengan Takahashi et al. (2010) untuk gen glukuronidase pada talus Porphyra yezoensis. Promoter yang umum digunakan dalam produksi rumput laut transgenik adalah 35S CaMV (cauliflower mosaicvirus) pada Laminaria japonica (Qin et al. 2005),
Kappaphycus alvarezii(Rajamuddin 2010), Porphyra yezoensis (Takahashi et al. 2010), danGracilaria gracilis(Huddyet al. 2012).
Metode yang umum digunakan dalam produksi tanaman transgenik adalah dengan bantuan Agrobacterium tumefaciens. Penggunaan A. tumefaciens dalam transformasi pada rumput laut telah berhasil dilakukan pada Porphyra yezoensis (Cheney et al. 2001). Namun demikian, hingga saat ini penggunaan A. tumefaciens dalam transformasi gen pada K. alvarezii belum ada yang melaporkan. Transformasi menggunakan A. tumefaciens memiliki beberapa keuntungan antara lain adalah biaya relatif lebih murah, jumlah salinan gen sedikit dan teknik pengulangan percobaan memberikan hasil serupa (reproducible) (Hiei et al. 1997). Agrobacterium tumefaciens mengandung vektor ekspresi biner. Vektor pertama merupakan bagian virulen dari A. tumefaciens, tetapi tanpa T- DNA, dan vektor kedua yang berukuran lebih kecil mengandung T-DNA dan gen yang akan disisipkan (Loeidin 1998).
Gen yang sudah banyak diteliti dalam usaha mengatasi infeksi bakteri pada organisme budidaya adalah gen lisozim. Lisozim dipergunakan untuk membuat transgenik ikan tahan infeksi bakteri, seperti ikan zebra (Yazawa et al. 2006), udang (Litopenaeus vannamei) (Burge et al. 2007) dan ikan salmon (Salmo salar L.) (Fletcher et al. 2011). Lisozim memiliki aktivitas bakterisidal yang mampu menghidrolisis ikatan -1,4-glikosida dari peptidoglikan yaitu antara asam N- asetil glukosamin dan asam N-asetil muramat yang merupakan penyusun dinding sel bakteri Gram positif (Liet al. 2008). Namun demikian, lisozim juga memiliki aktivitas litik pada beberapa bakteri Gram negatif.
Lisozim ayam telah dilaporkan memiliki aktivitas litik terhadap Micrococcus lysodeikticus, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophilla danVibrio anguillarum(Yazawaet al. 2006). Lisozimmampu membunuh bakteri Gram negatif, yang ditemukan pada bivalvia dan udang (Liet al. 2008). Aktivitas litik darilisozimpada F2 ikan salmon transgenik adalah 40% lebih besar daripada ikan salmon bukan transgenik (Fletcher et al. 2011). Transgenik ikan zebra yang mengekspresikan lisozim ayam menunjukkan bahwa F2 ikan transgenik 65% tahan infeksi F. columnare dan 60% tahan terhadap infeksi Edwardsiella tarda, sedangkan 100% ikan zebra kontrol tidak tahan terhadap infeksi bakteri tersebut (Yazawaet al. 2006).
Kemampuan lisozim ayam dalam merusak dinding sel bakteri Gram positif dan beberapa bakteri Gram negatif ini merupakan potensi yang dapat dimanfaatkan dalam upaya meningkatkan resistensi rumput laut terhadap bakteri patogen, terutama infeksi bakteri yang diduga sebagai penyebab penyakitice-ice.
Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah:
1. Mengkonstruksi plasmid rekombinan pembawa gen lisozim untuk transformasi melaluiAgrobacterium tumefaciens
2. Mengevaluasi persentase transformasi dan integrasi gen lisozim yang diintroduksikan pada talus rumput laut Kappaphycus alvarezii melalui Agrobacterium tumefaciens.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai efektivitas Agrobacterium tumefaciens dalam transformasi dan integrasi gen lisozim. Selanjutnya rumput laut Kappaphycus alvarezii yang dihasilkan dapat menjadi varietas tahan infeksi bakteri.