RIWAYAT HIDUP

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMAS

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 1 April 1974 dari ayah Let.Kol.Pol.(Purn.) Emon Sadi dan ibu Nunung R. Pada tanggal 10 Agustus 1997 penulis menikah dengan Ir. Gunawan Pratama Yoga, M.Sc., dan saat ini telah dikaruniai dua orang putri yaitu Ajeng Meiwita Nurrizky dan Vitaya Nur Khaleeda.

Setelah lulus dari Sekolah Menengah Analis Kimia Bogor pada tahun 1993, penulis bekerja di Puslit Limnologi LIPI sebagai analis kimia air. Perkenalan dengan dunia bakteri dimulai pada tahun 2002 ketika penulis ditugaskan di Laboratorium Mikrobiota pada puslit yang sama. Pada awalnya

penulis banyak ‘bersentuhan’ dengan bakteri fotosintetik anoksigenik dan

metabolisme sulfidanya dalam penerapannya sebagai agen bioremediasi perairan. Pada tahun 2000 penulis mendapat kesempatan melanjutkan pendidikan sarjana pada Program Studi Kimia FMIPA Universitas Pakuan, Bogor. Dengan mengambil tema skripsi mengenai karakteristik penyerapan beberapa logam berat pada bakteri fotosintetik anoksigenik (BFA), penulis lulus dan memperoleh gelar Sarjana Sains pada tahun 2005.

Atas dukungan dari Dr. Tri Widiyanto, M.Si., sebagai Kepala Bidang Produktivitas Perairan Darat Puslit Limnologi LIPI, tahun 2007 penulis melanjutkan pendidikan pascasarjana S2 pada Program Studi Biokimia, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Selama mengikuti perkuliahan di Program Studi Biokimia, penulis sangat tertarik pada bidang enzimologi. Artikel mengenai pemanfaatan enzim dalam pengolahan limbah pestisida yang dibuat penulis dan dimuat pada majalah Warta Limnologi tahun 2008, telah di ulas oleh harian Koran Jakarta pada bulan Oktober 2008.

Saat menjalani studi pascasarjana, pada tahun 2008 penulis mendapat kepercayaan dari Tanoto Foundation berupa pemberian beasiswa kepada penulis. Pada tahun yang sama penulis menjadi anggota dari Perhimpunan Biokimia dan Biologi Molekuler.

DAFTAR ISI

Halaman

Daftar Tabel i

Daftar Gambar ii

Daftar Lampiran iii

PENDAHULUAN... 1 TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri Tahan Krom ... Reduksi Krom (VI) secara Enzimatis pada Beberapa Bakteri ... 16S RNA Ribosoma (rRNA) ...………... Reaktor Pengolah Limbah Pelapisan Krom ...

6 8 11 13

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian ... Alat dan Bahan ... Metode Penelitian ...

17 17 18

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) ... Hasil Identifikasi Isolat Unggul Tahan Cr(VI) ... Aktivitas Enzim Cr(VI) Reduktase ...

25 28 31

SIMPULAN DAN SARAN ... 36 DAFTAR PUSTAKA ... 37 LAMPIRAN ... 42

DAFTAR TABEL

Halaman 1. Nilai Km dan Vmax dari enzim pereduksi Cr(VI) yang diisolasi dari

beberapa jenis bakteri

2. Hasil pengujian aktivitas enzim Cr(VI) reduktase pada ekstrak kasar enzim dari isolat Ralstonia sp. Cr6NS

DAFTAR GAMBAR

Halaman 1. Kerangka pemikiran penelitian ... 5 2. Pohon filogenetik rDNA ... 12 3. Disain reaktor kolom dan instalasi reaktor kolom pengolahan

limbah cair pelapisn logam dan limbah dari kegiatan analisis

Laboratorium Hidrokimia Puslit Limnologi LIPI ... 14 4. Ukuran Fe(0) yang digunakan dalam reaktor kolom... 15 5. Pertumbuhan koloni di tepi kertas saring pada uji resistensi

terhadap Cr(VI) 250 mg/L ... 25 6. Bentuk koloni ke enam isolat bakteri tahan Cr(VI) ... 26 7. Bentuk kurva pertumbuhan ke enam isolat bakteri tahan Cr(VI) ... 27 8. Nilai daya penyisihan isolat bakteri tahan Cr(VI)

...

9. Hasil elektroforesis amplikon

...

10.Hasil pensejajaran urutan basa dari primer 9F pada program

BLASTN ... 30 11.Hasil analisis taksonomi dari genus Ralstonia pada program

BLASTN ... 30 12.Kurva pertumbuhan Ralstonia sp. Cr6NS dalam medium PYECr-25

100% ... 32 13.Mekanisme penyerapan Cr(VI) oleh sel hidup O. anthropi ... 34 14.Pengaruh penambahan NADH sebagai donor elektron terhadap

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Komposisi medium Peptone Yeast Extract (PYE) ... 42 2. Analisis protein (metoda Bradford) ... 43 3. Analisis kadar krom(VI) dengan metoda difenilkarbazida ... 44 4. Bentuk koloni dan bentuk sel isolat bakteri tahan Cr(VI) ... 45 5. Kromatogram hasil sekuens 16S rDNA ... 60

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kromium heksavalen, Cr(VI), merupakan bahan pencemar lingkungan yang bersifat toksik, mutagenik, dan karsinogenik bagi hampir semua mahluk hidup (ATSDR, 2001; Sugden, et.al,. 2001). Oksianion kromat (CrO42-) adalah

bentuk Cr(VI) yang paling toksik dan bersifat mudah larut. Struktur kromat yang mirip ion fosfat dan sulfat menjadikannya lebih mudah masuk melewati membran sel dengan perantaraan jalur penukaran untuk anion fosfat dan sulfat (Alexander and Aaseth, 1995; Ohtake, et.el., 1987). Ion Cr(VI) di dalam sel akan direduksi oleh glutation menjadi Cr(III) melalui pembentukan senyawa antara Cr(V) dan Cr(IV) dan radikal dari oksigen (ROS) (Goyer, 1986; Shi and Dalal, 1988; Sumner, et.el. 2005).

Toksisitas Cr(VI) diakibatkan oleh sifat Cr(VI) sebagai oksidator kuat dan juga karena dalam reaksi reduksinya pada sistem biologis menghasilkan spesies- spesies radikal yang tidak stabil seperti reactive oxygen species (ROS) dan Cr(V) (ATSDR, 2001; Sumner, et.al., 2005). Potensi genotoksisitas kromium valensi tinggi dipelajari oleh Sugden, et.al. (2001), secara in vitro dengan menggunakan kompleks Cr(V)-organik dan oligonukleotida sintetik berbasa 25 (5’- d(ATGGCGTAATCATXGTC-ATAGCTGT)-3’). Kerusakan oksidatif akibat senyawa antara Cr(V) memacu pembentukan basa termodifikasi, terutama 8-okso- G. Bentuk senyawa ini sangat tidak stabil dan mudah teroksidasi menjadi guanidinohidantoin (GH) dan spiroiminodihidantoin (SH). GH dan SH telah lama digunakan sebagai biomarker bagi tingkat keparahan penyakit seperti kanker dan penuaan (aging). GH dan SH bersifat mutagenik karena menyebabkan kesalahan penggabungan oposit dimana basa sitosin yang seharusnya bergabung digantikan oleh adenin. Akibat lanjutnya ketika terjadi replikasi atau transkripsi, basa G akan digantikan oleh basa T. Walau penelitian ini dilakukan secara in vitro, penemuan ini dapat menggambarkan mekanisme in vivo dari interaksi kromium dengan oligonukleotida yang menghasilkan lesi DNA akibat reaksi mutasi transversi G

Jalur utama masuknya Cr(VI) ke dalam tubuh manusia adalah melalui pernafasan, pencernaan, dan absorpsi oleh kulit. Organ yang menjadi target toksisitas Cr(VI) yang masuk melalui pernafasan adalah paru-paru sehingga meningkatkan resiko kanker paru-paru. Pencemaran kromium di udara disebabkan antara lain oleh hasil pembakaran bahan bakar minyak dan dari menara pendingin pabrik yang menggunakan bahan kimia yang mengandung kromat sebagai bahan pencegah karat. Cr(VI) yang kontak dengan kulit akan menimbulkan gejala dermatitis dan pelepuhan kulit. Penelitian yang dilakukan di Amerika Serikat mendapatkan bahwa sekitar 20% dari pekerja yang bidang kerjanya terpapar Cr(VI), seperti pekerja percetakan, tukang cat, penyamakan kulit, dan pekerja bangunan, menunjukkan gejala alergi dermatitis dalam bentuk eksim di kulit (ATSDR, 2001).

Studi yang dilakukan Sumner, et.al. (2005), menunjukkan bahwa pada ragi Saccharomyces cerevisiae toksisitas Cr(VI) terutama disebabkan oksidasi protein oleh spesies oksigen reaktif (ROS), dibandingkan interaksi ROS dengan makromolekul lainnya seperti fosfolipid dan DNA. Sejumlah enzim glikolitik dan

heat-shock protein (HSP) menjadi target spesifik perusakan oksidatif akibat Cr. Toksisitas Cr(VI) pada beberapa tanaman, seperti tebu, buncis, padi, jagung, dan lain-lain, telah dipelajari. Pemaparan kromium berefek terhadap proses pertumbuhan dan perkembangan tanaman dan fisiologis tanaman (Shanker, et.al., 2005). Efek Cr(VI) terhadap respon pertumbuhan alga hijau Chlorella pyrenoidosa telah dipelajari oleh Hörcsik dan Balogh (2002). Peningkatan konsentrasi Cr(VI) dengan nyata mempengaruhi pertumbuhan alga ini dengan nilai EC50 sebesar 1,6 mg/L dan nilai LC50 pada kisaran 20 mg/L, walau pada

konsentrasi yang sangat rendah kromium meningkatkan pertumbuhan alga. Akumulasi kromium terbesar terdapat pada dinding sel alga, yaitu sebesar 70%, sementara jumlah kromium pada fraksi membran setara dengan jumlah pada fraksi terlarut. Masuknya kromium ke dalam sel alga diduga melalui mekanisme pertukaran ion dengan besi dan terutama magnesium.

Asupan Cr(VI) ke lingkungan perairan berasal dari lingkungan alamiah dan berbagai industri seperti pertambangan, penyamakan kulit, pelapisan logam, pengawetan kayu, industri pembuatan zat warna, dan bahan pencegah korosi.

Industri penyamakan kulit dan pengolahan kulit, industri pembuatan baja, dan industri elektronik dan peralatan listrik merupakan sumber utama limbah kromium industrial. Konsentrasi Cr(VI) yang terdapat dalam limbah dari ketiga jenis industri diatas berkisar antara 0,1 – 100 mg/L. Teknologi konvensional pengolahan limbah yang mengandung Cr(VI) sebagian besar melibatkan metoda reduksi Cr(VI) secara kimia membentuk Cr(III) yang kurang toksik dan dilanjutkan dengan tahap pengendapan dalam kondisi basa (Patterson, et.al., 1998). Menurut Ganguli dan Tripathi (2002), metoda pengolahan limbah Cr(VI) konvensional membutuhkan bahan kimia dan sumber energi dalam jumlah besar sehingga cara tersebut secara ekonomis kurang cocok untuk diterapkan pada industri berskala kecil. Selain itu, studi pendahuluan menunjukkan bahwa reaktor pengolahan limbah pelapisan logam yang menggunakan metoda reduksi oleh serbuk besi (dalam bentuk Fe(0) dan Fe(II)) menghasilkan efluen yang mengandung Fe (II) terlarut 68,062 mg/L dan Fe(III) terlarut 50,383 mg/L.

Sejumlah bakteri telah diketahui kemampuannya dalam mereduksi Cr(VI) menjadi Cr(III) yang tidak toksik (Bopp, et.al., 1983; Goris, 2001; McLean and Beveridge, 2001; Michel, et.al., 2001) dan telah dipelajari kemampuannya dalam pengolahan air yang tercemar Cr(VI) (Bhide, et.al., 1996; Ganguli and Tripathi, 2002). Reduksi Cr(VI) menjadi Cr(III) secara biologis menawarkan suatu alternatif baru dalam penanganan limbah berCr(VI) karena lebih ekonomis, aman, dan berkelanjutan (Eccless dalam Ganguli and Tripathi, 2002). Dalam proses reduksi tersebut, bakteri-bakteri menggunakan berbagai tipe enzim Cr(VI)- reduktase (enzim ekstraseluler, enzim sitoplasma terlarut, enzim yang terikat pada membran plasma, atau sitokrom). Enzim Cr(VI) reduktase yang dimiliki bakteri memberikan peluang untuk dimanfaatkan dalam mengatasi masalah pencemaran Cr(VI) di lingkungan perairan dan tanah yang tidak dapat diolah menggunakan sistem pengolah limbah biologis, atau merupakan pelengkap bagi sistem pengolahan limbah yang telah ada (Goris, et.al., 2001).

Salah satu aspek penting dalam pengolahan limbah secara biologis dengan menggunakan bakteri sebagai agen bioremediasi adalah identifikasi bakteri. Identifikasi bakteri bertujuan untuk memastikan bahwa teknologi yang digunakan bersifat aman dan tidak membahayakan kesehatan lingkungan sekitar (Tani,

et.al., 2002). Identifikasi bakteri dapat dilakukan melalui pengamatan morfologi, pengujian biokimia terhadap struktur sel maupun produk yang dihasilkan, atau melalui pendekatan molekuler. Salah satu metoda identifikasi bakteri secara molekuler adalah dengan melakukan perbandingan urutan basa 16S RNA ribosom (rRNA) (Pangastuti, 2006). Identifikasi berdasarkan urutan basa 16S rRNA telah banyak diterapkan, antara lain dalam bidang kesehatan (Claridge,

et.al., 2004), pertanian (Khakvar, et.al., 2008), dan pertahanan (Sacchi, et.al., 2002).

Tujuan Penelitian

Penelitian yang telah dilakukan bertujuan untuk mengisolasi bakteri tahan Cr(VI) berkonsentrasi tinggi dari efluen reaktor pengolahan limbah pelapisan logam sebagai sumber isolat, menyeleksi isolat unggul, mengidentifikasi isolat unggul melalui analisis 16S rRNA, melakukan isolasi enzim Cr(VI) reduktase dari isolat unggul, dan menguji aktivitas enzim Cr(VI) reduktase.

Manfaat Penelitian

Isolat bakteri tahan Cr(VI) diharapkan dapat dimanfaatkan dalam pengolahan limbah yang mengandung Cr(VI) dan enzim Cr(VI) reduktase yang dihasilkan oleh bakteri tahan Cr(VI) dapat dimanfaatkan untuk aplikasi lain seperti biosensors Cr(VI).

Hipotesis

1. Dalam reaktor pengolahan limbah pelapisan logam krom terdapat isolat bakteri yang tahan terhadap Cr(VI) berkonsentrasi tinggi.

2. Bakteri yang tahan Cr(VI) konsentrasi tinggi dapat mereduksi Cr(VI). 3. Bakteri yang dapat mereduksi Cr(VI) dapat memproduksi enzim Cr(VI)

reduktase.

Kerangka Pemikiran

Reaktor pengolahan limbah pelapisan logam krom yang terdapat di Laboratorium Pengendalian Pencemaran Puslit Limnologi LIPI adalah pengolah

limbah kimiawi yang menggunakan prinsip reaksi redoks dalam menyisihkan Cr(VI). Cr(VI) yang berasal dari limbah pelapisan logam dalam reaktor tersebut direduksi oleh logam besi Fe0 sehingga terbentuk Cr3+ yang kemudian mengendap bersama-sama Fe3+ hasil oksidasi dan keluar sebagai efluen reaktor. Efluen reaktor dengan konsentrasi logam-logam yang tinggi diduga mengandung bakteri yang tahan terhadap logam Cr(VI) yang toksik dengan reaksi reduksi Cr(VI) secara enzimatis sebagai strategi pertahanannya. Bakteri tahan Cr(VI) tersebut diisolasi dan diidentifikasi, untuk kemudian dipilih satu isolat unggul yang memiliki daya penyisihan Cr(VI) tertinggi dan dikarakterisasi sistem enzim Cr(VI)-reduktase yang dimilikinya. Kerangka pemikiran penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 1.

Efluen Reaktor Pengolahan Limbah Pelapisan Logam Isolasi Bakteri Tahan Cr(VI)

Pengamatan morfologi (warna dan bentuk koloni, bentuk sel, pewarnaan Gram), pengelompokan, & pengamatan kurva

pertumbuhan Uji eliminasi Cr(VI)

Ektrasi enzim : Ekstraseluler, periplasmik, sitoplasmik Analisis 16S rRNA Isolat unggul

Uji aktivitas enzim

TINJAUAN PUSTAKA

Bakteri Tahan Krom

Banyak mikroorganisme dapat hidup dan bereproduksi dalam habitat yang terkontaminasi logam berat seperti Cr(VI). Kelompok Pseudomonas,

Enterobacteria, Streptomyces spp., dan Corynebacteria yang diisolasi dari sedimen sungai Ottawa yang tercemar limbah industri mampu hidup dalam medium yang mengandung 100 µg Cr(VI) /L, dengan Pseudomonas sebagai kelompok yang paling banyak ditemukan (Luli, et.al., 1983). Dari lindi tempat pembuangan akhir sampah, Larashati (2004) mengisolasi bakteri Bacillus pumilus, Bacillus firmus, dan Bacillus brevis yang tahan terhadap kromat dalam konsentrasi tinggi dan mampu menyisihkan kromat dari medium. B. pumilus dan

B. firmus resisten terhadap kromat sampai konsentrasi 500 mg/L, sedangkan

Bacillus brevis resisten sampai konsentrasi kromat mencapai 400 mg/L. Bakteri jenis Bacillus banyak ditemukan di tempat pembuangan sampah dan ada yang memiliki resistensi dan kemampuan reduksi terhadap Cr(VI).

Kemampuan mikroorganisme untuk hidup dalam lingkungan yang terkontaminasi logam berat disebabkan oleh sejumlah mekanisme pertahanan yang dikembangkan mikroorganisme dalam mengatasi toksisitas logam berat. Gadd (1990) menyebutkan bahwa mekanisme pertahanan tersebut dapat melalui:

1. Presipitasi atau pembentukan kompleks ekstraseluler.

2. Menurunkan permeabilitas logam atau transport logam melewati membran sel.

3. Kompartementalisasi intraseluler, antara lain melalui penumpukan dalam vakuola.

4. Detoksifikasi melalui sejumlah reaksi kimia dalam sel.

Sedangkan menurut Bontidean, et.al. (2000) umumnya daya tahan bakteri terhadap berbagai jenis logam berat disebabkan adanya suatu faktor penentu yang memberikan resitensi terhadap satu atau sejumlah kecil logam berat. Mungkin karena bakteri adalah sel sederhana dengan kompartemen yang sederhana, pada umumnya resistensi bersifat sederhana untuk satu atau beberapa logam. Mekanisme resistensi pada bakteri meliputi pengaliran logam keluar sel bakteri

(efluks logam), modifikasi spesies logam, pengurungan logam, atau kombinasi dari mekanisme tadi. Mayoritas faktor penentu resistensi logam bersifat terinduksi oleh ion logam. Sistem metaloregulator yang telah diidentifikasi hingga saat ini adalah untuk kation atau oksianion Ag, As, Cd, Cr, Cu, Fe, dan Hg (Bontidean, et. al., 2000).

Terdapat indikasi bahwa resistensi terhadap kromium berkorelasi dengan keberadaan plasmid pada beberapa isolat (Bopp, et.el., 1983; Luli, et.al., 1983; Ohtake, et.al. 1987). Pseudomonas fluorescens LB300 yang diisolasi dari sedimen sungai Hudson yang terkontaminasi kromium dapat tumbuh dalam medium yang mengandung lebih dari 1,5 mg K2CrO4 per mL atau 200 kali lebih

resisten dibandingkan bakteri lain yang diisolasi dari lokasi yang sama. Resistensi terhadap Cr(VI) ini diperoleh dari plasmid pLHB1 (Bopp, et.al.,1983). Penelitian selanjutnya terhadap bakteri yang sama, yaitu Pseudomonas fluorescens LB300, mendapatkan bahwa adanya plasmid pLBH1 berhubungan dengan penurunan penyerapan Cr(VI). Strain sensitif-Cr(VI) P. fluorescens LB303 yang tidak memiliki plasmid, menyerap Cr(VI) 2,2 kali lebih banyak dibandingkan P. fluorescens LB300 yang resisten-Cr(VI). Selain itu, sensitivitas seluler terhadap kromat dipengaruhi oleh sulfat (Ohtake, et.al., 1987).

Hasil penelitian Wang, et.al. (1990) mendapatkan bahwa pada

Enterobacter cloacae HO1 yang diisolasi dari lumpur aktif menggunakan CrO42-

sebagai akseptor elektron pada kondisi anaerob dengan cara mereduksinya. Hal ini ditandai oleh:

1. Pertumbuhan bakteri dalam kondisi anaerob yang disertai dengan penurunan krom dalam medium.

2. Aktivitas reduksi-kromat pada sel yang sedang tumbuh dihambat oleh oksigen.

3. Reduksi terjadi lebih cepat dalam sel yang ditumbuhkan dalam medium gliserol dan asetat dibandingkan sel yang ditumbuhkan dalam medium glukosa.

Banyak lingkungan asam yang terjadi secara alami maupun yang diakibatkan oleh kegiatan manusia kaya akan krom dan logam-logam lainnya. Pada kondisi yang demikian, toksisitas logam seringkali muncul karena logam-

logam terdapat dalam bentuk yang bioavailable. Penelitian Cummings dan kawan-kawan (2007) mendapatkan bahwa bakteri pereduksi Fe(III) Acidiphilum cryptum memiliki toleransi yang tinggi terhadap beberapa logam berat termasuk Cr(VI) dan mampu mereduksi Cr(VI) melalui dua cara. Cara pertama, Cr(VI) direduksi secara langsung oleh komponen seluler yang sensitif terhadap Hg2+ dan tergantung pH (enzim). Reduksi Cr(VI) secara enzimatis ini tidak berhubungan dengan konservasi energi, tetapi lebih ditujukan sebagai strategi detoksifikasi. Cara kedua, Cr(VI) direduksi secara tidak langsung melalui perantaraan reaksi reduksi enzimatis Fe(III) menjadi Fe(II) yang secara cepat mentranspor elektronnya ke Cr(VI) sehingga tereduksi menjadi Cr(III) dalam tiga kali transfer elektron. Cara kedua tersebut dapat ditemui pada respirasi mikroba seperti

Shewanell alga strain BrY (Wielinga, et.al., 2001). Pada bakteri tersebut reduksi besi merupakan proses penerimaan elektron terminal (TEAP, terminal electron accepting process) yang dominan dan reduksi tak langsung terhadap kromat oleh hasil samping respirasi tampaknya merupakan jalur reduktif utama seperti pada reaksi berikut: ¾ C3H5O3 - + 3Fe(OH)3 ¾ C2H3O2 - + 3Fe2+ + ¾ HCO3 - + 2H2O + 5¼ OH - (1) 3Fe2+ + HCrO4 - + 8H2O  3Fe(OH)3 + Cr(OH)3 + 5H+ (2)

Reduksi Krom (VI) secara Enzimatis pada Beberapa Bakteri

Beberapa penelitian pada sejumlah bakteri yang berbeda mendapatkan bahwa akumulasi kromium tampaknya melibatkan proses reduksi enzimatis ekstraseluler atau intraseluler, atau keduanya dengan salah satu proses sebagai proses reduksi utamanya seperti isolat Pseudomonad CRB5 (Mc Lean, 2000). Berbagai spesies bakteri mengembangkan sistem reduksi Cr(VI) yang berbeda- beda, bahkan pada spesies yang sama seperti Pseudomonas putida PRS2000 (Ishibashi, et.al., 1990) dan Pseudomonas putida MK1 (Park, et.al., 2000) memiliki enzim terlarut yang sifatnya sangat berbeda yang digunakan untuk mereduksi Cr(VI).

Pseudomonas putida PRS2000 yang dipelajari oleh Ishibashi dan kawan- kawan (1990) diketahui memiliki aktivitas enzim kromium reduktase dalam ekstrak sel, sementara pada fraksi membran sel tidak ditemukan aktivitas pereduksi krom (VI). Enzim terlarut ini bersifat heat labile dimana pemanasan pada 50oC selama 10 menit dapat menurunkan aktivitas hingga 40-50%, sementara pH optimum diperoleh pada kisaran 6,5 – 7,5. Ekstrak enzim dari sel

P. putida PRS2000 membutuhkan NADH atau NADPH sebagai donor elektron untuk mereduksi kromat. Walau konsentrasi sulfat dalam medium mempengaruhi sensitivitas seluler terhadap Cr(VI) (sebagai CrO42-) (Ohtake, et.al., 1987),

reduksi kromat tidak dipengaruhi oleh sulfat dan oksianion lain (SO32-, MoO42-,

VO42-, PO42-, dan NO3-), serta Cr3+. Hg2+ dan Ag+ merupakan inhibitor kuat bagi

enzim ini.

Enzim solubel pereduksi Cr(VI) yang didapatkan dari ekstrak periplasma sel P. putida MK1 (Park, et.al., 2000) memiliki perbedaan dari P. putida

PRS2000, dimana enzim MK1 memiliki pH optimum 5,0 dan suhu optimum 80oC. Selain itu, enzim MK1 ini dihambat oleh sulfat, sedangkan enzim PRS2000 tidak terhambat. Karena kromat dengan mudah melewati membran sel dan di dalam sitoplasma bersifat toksik, maka sifat enzim MK1 sebagai protein periplasmik memberi keuntungan bagi sel karena detoksifikasi kromat dapat langsung terjadi begitu kromat memasuki sel bakteri.

Proses reduksi enzimatis ekstraseluler ditemukan di bakteri Enterobacter cloacae HO1, Escherichia coli ATCC 33456, dan Ochrobactrum anthtopi. Wang,

et.al. (1990) mendapatkan bahwa, pada Enterobacter cloacae HO1 dalam kondisi anaerobik, aktivitas tertinggi enzim yang dapat mereduksi Cr(VI) terdapat di fraksi membran sel. Aktivitas enzim kromat-reduktase membran paling tinggi (yaitu sebesar 5,47 µg CrO42-/menit/mg protein) terjadi ketika fenazin metosulfat

yang telah direduksi oleh asam askorbat ditambahkan sebagai donor elektron ke dalam medium. Pemanasan membran sel pada 100oC selama satu menit menyebabkan hilangnya aktivitas reduksi (Wang, et.al, 1990). Penelitian terhadap

E. coli ATCC 33456 yang dilakukan Shen dan Wang (1993) mendapatkan bahwa reduksi Cr(VI) menjadi Cr(III) sebagian besar terjadi dalam medium eksternal. Sementara penelitian terhadap O. anthropi (Li, et.al., 2008) mendapatkan bahwa

reduksi enzimatis ekstraseluler mendominasi reduksi Cr(VI) dan hanya sebagian kecil saja Cr(VI) ditemukan di dalam sel dan tereduksi menjadi Cr(III). Akumulasi kromium dipermukaan sel menyebabkan permukaan sel menjadi kasar.

Reduksi enzimatis Cr(VI) menjadi Cr(III) secara intraseluler ditemukan pada P. ambigua G-1 (Suzuki, et.al.,1992), P. putida (Ishibashi et al., 1990; Park, et.al., 2000; Ackerley, et.al., 2004), dan P.fluorescens (Mc Lean, 2000 dan 2001) yang menggunakan enzim reduktase terlarut yang terdapat di dalam sitoplasma untuk mereduksi kromat baik secara aerobik maupun anaerobik. Walau demikian laju reduksi tertinggi terjadi di dalam kondisi anaerobik. Beberapa enzim yang diketahui memiliki aktivitas pereduksi-Cr(VI) adalah glutation reduktase, aldehida oksidase, dan sitokrom P-450 (Suzuki, et.al., 1992).

Suzuki, et.al. (1992) mendapatkan bahwa ekstrak sel P. ambigua G-1 membutuhkan 3 mol NADH sebagai donor elektron untuk mereduksi secara enzimatis 1 mol Cr(VI) menjadi Cr(III). Dalam reaksi ini, Cr(V) terbentuk sebagai senyawa antara sehingga Suzuki dan kawan-awan menyimpulkan bahwa reaksi reduksi Cr(VI) adalah reaksi dua tahap. Pertama, Cr(VI) menerima satu elektron dari satu molekul NADH dan menghasilkan senyawa antara Cr(V). Tahap kedua, senyawa antara Cr(V) menerima dua elektron dari dua molekul NADH sehingga terbentuk Cr(III). Tahap pertama terjadi lebih cepat dari tahap kedua. Pada kedua tahap ini, NADH berubah menjadi NAD+.

Isolat Pseudomonad CRB5 yang berkerabat dekat dengan P. fluorescens

mereduksi Cr(VI) menjadi Cr(III) menggunakan enzim terlarut yang kemungkinan besar terdapat di sitoplasma atau di periplasma, sementara pada fraksi membran plasma tidak ditemukan aktivitas kromat reduktase (Mc Lean, 2000; Mc Lean and Beveridge, 2001). Aktivitas enzim reduktase ini juga ditemukan dalam medium setelah 48 jam inkubasi. Hal ini mungkin merupakan suatu proses detoksifikasi ekstraseluler dimana enzim disekresikan ke lingkungan yang terkontaminasi Cr(VI) atau keberadaannya disebabkan oleh lisis sel yang mati. Isolat CR5 tidak membutuhkan donor elektron eksternal seperti NADH, tetapi isolat ini dapat menggunakan sumber elektron endogenus. Walau demikian,

reduksi minor Cr(VI) yang berasosiasi dengan membran ditemukan dalam kondisi anaerob non-pertumbuhan dengan adanya donor elektron organik.

Tabel 1 menyajikan nilai Km dan Vmax enzim pereduksi Cr(VI) dari

beberapa bakteri. Enzim pereduksi Cr(VI) dari bakteri P. putida, yang telah dipurifikasi menggunakan kolom Superose 12 HR 10/30, memiliki nilai Km dan

Vmax yang lebih tinggi dibandingkan bakteri lainnya. Metoda pemurnian enzim

mempengaruhi nilai Km dan Vmax enzim.

Tabel 1. Nilai Km dan Vmax dari enzim peredusi Cr(VI) yang diisolasi dari

beberapa jenis bakteri.

Bakteri Lokasi Enzim Metoda Purfikasi Donor Elektron Km Vmax Pustaka

P. putida sitoplasma Superose

12 HR 10/30 NADH 374 µM 1,72 µmol/menit/mg protein Park, et.al., 2000 Bacillus sp. sitoplasma (NH4)2SO4 NADH 14 µM 3,8 nmol/menit/mg protein Elangovan, et.al., 2006

V. harveyi sitoplasma Sephadex G-75 NADH 5,4 µM 10 nmol/menit/mg protein Kwak, et.al., 2003

P.ambigua sitoplasma Sephadex G-75 NADH 13 µM 27 nmol/menit/mg protein Kwak, et.al., 2003

16S RNA Ribosom (rRNA)

RNA ribosom (rRNA) merupakan komponen inti dari mesin pembentuk protein pada semua makhluk hidup yaitu ribosom. Molekul rRNA bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme (Pangastuti, 2006). Ribosom merupakan kompleks ribonukleoprotein yang terdiri atas dua subunit yaitu subunit kecil (small subunit) dan subunit besar (large subunit). Terdapat tiga jenis RNA dalam ribosom prokaryot berdasarkan nilai koefisien sedimentasi,

Dalam dokumen Identifikasi Isolat Bakteri Tahan Krom(VI) dan Pengujian Aktivitas Enzim Krom(VI) Reduktase (Halaman 96-162)