METODE PENELITIAN
3.2. Sampel Penelitian
Jumlah sampel mencit (Mus Musculus) Strain DD Webster diambil berdasarkan rumus t(r – 1) >20 (Sugandi, 1994), jika t adalah jumlah kelompok (dalam penelitian ini terdiri dari 4 kelompok) dan r adalah jumlah ulangan per kelompok, maka jumlah ulangan adalah sebesar 9 mencit per kelompok maka jumlah mencit keempat kelompok adalah lebih dari 32 ekor.
3.3.Bahan dan Alat Penelitian 3.3.1. Bahan Penelitian
a. Ekstrak teh hijau
Daun teh hijau (Camalia sinensis) diperoleh dari perkebunan
Sayur, Pematang Siantar Martoba. Pucuk daun teh yang dipetik adalah 3 daun dari pucuk, dikeringkan dengan sinar matahari selama 1 jam hingga layu, kemudian dimasukkan dalam ruang ber AC dengan suhu dibawah 27 0C selama 8 sampai dengan 12 jam dan dibalik setiap 2 jam. Daun kemudian dimasukkan dalam balancer digiling untuk membuang pasir dan menambah
aroma teh selama 30 menit dengan putaran 30 kali per menit. Daun teh yang siap diolah dimasukkan kedalam rotary power dengan suhu 250 – 3500C
selama 6 – 7 menit, masukkan ke mouter roller selama 3 - 4 menit untuk
digiling, lalu pengeringan pertama di dalam dryer dengan suhu 1100C selama
35 menit hingga kadar air 30 %. Kemudian proses pembentukan dimana daun teh dimasukkan kedalam kantung kain selama 8 – 10 jam di bolak baik sebanyak 40 kali, lalu dilakukan pengeringan kedua hingga kadar air 3 – 5 %, pemisahan daun dan batang teh. Daun teh hijau yang kering telah siap untuk digunakan. Sebelum di pasarkan, daun teh hijau yang telah disimpan beberapa lama dilakukan pengeringan ketiga (Komunikasi pribadi dengan pemilik : Drs. I Ketut Praptanta). Daun teh hijau yang sudah kering kemudian di ekstrak pada Laboratorium Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara.
Prosedur Ekstraksi
Ekstrak teh hijau dilakukan dengan cara menyeduh daun kering teh hijau dengan air panas selama 5 menit pada suhu + 970C, disaring hingga terpisah filtrat dan ampasnya (Gambar 3). Ampas diseduh kembali seperti diatas sebanyak 2 kali hingga air seduhan kelihatan jernih dan seluruh filtrat
46
disatukan. Seluruh filtrat yang dihasilkan dikeringkan diatas waterbath
hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak kental di freeze-dried untuk menghasilkan ekstrak kering (Harborne, 1987; Murase et al,2005) (Gambar 4 dan 5).
Diseduh dengan air panas suhu 970C selama 5 menit Disaring
(2000 gr) Daun Kering Teh Hijau
Uapkan diatas Diseduh dengan air panas
Waterbath Suhu 970C selama 5 menit
Disaring
(Ulangi hingga seduhan
Freeze dried kelihatan jernih)
Filtrat Ampas
Ekstrak Kering
(320 gr) Ekstrak Kental
Filtrat
Gambar 5. Pengeringan dengan waterbath
b. Diet tinggi lemak.
Makanan tinggi lemak yang akan digunakan pada penelitian ini adalah makanan berupa pellet dengan kode 551 (PT Charoen Pokphand, Indonesia) ditambahkan kolesterol dari kuning telur 1,5%, lemak kambing 10 % dan minyak kelapa 1 %. Pakan yang dibutuhkan untuk seluruh mencit selama penelitian 42 hari kurang lebih 15 kg. Pakan tinggi lemak dibuat dengan cara menggiling pellet 551 hingga halus sebanyak 7.725 g, ditambahkan kuning telur sebanyak 5.625 g, lemak kambing 1500 g, 150 ml minyak kelapa. Bahan tersebut dicampurkan hingga rata, dibentuk berupa silinder dengan ukuran diameter 0,5 cm, panjang 3 cm kemudian dikeringkan dibawah sinar matahari (Hardiningsih dan Nurhidayat, 2006).
Cara mempersiapkan diet tinggi lemak yaitu dengan cara mengikuti tahap-tahapan dibawah ini. Pertama-tama mempersiapkan lemak kambing sebanyak 1500 gr, memanaskan lemak kambing dengan cara menggoreng selama kurang lebih 2 jam hingga lemak kambing menjadi minyak dan sisanya menjadi seperti kerupuk. Kedua, mempersiapkan minyak kelapa dengan cara mengambil daging kelapa tua sebanyak 3 buah dan diparut, diambil patinya kemudian pati tersebut dipanaskan diatas kuali hingga terpisah ampas dan minyak kelapa. Dan minyak kelapa disaring, diambil sebanyak 150 ml. Ketiga, mempersiapkan kuning telur. Telur direbus hingga matang, pisahkan kuning telur dengan putih telur, keringkan kuning telur dengan suhu 600C selama 2 jam didalam oven dan telur sudah siap untuk diadon.
Bahan-bahan yang telah disiapkan diadon dengan cara meletakkan pellet 551 sebanyak 7.725 g dalam sebuah wadah yang telah disediakan. Tuangkan minyak kambing yang baru saja disiapkan (minyak masih dalam kondisi panas) diaduk dan dibiarkan selama 20 menit. Tambahkan air sebanyak 8 liter, aduk dan tunggu selama kurang lebih 1 jam hingga pakan lembut dan mudah untuk diadon. Sisa lemak kambing berupa kerupuk juga dihancurkan dan diadon bersama dengan pellet 551 didalam wadah hingga rata. Tambahkan minyak kelapa sebanyak 150 ml kedalam adonan dan aduk kembali hingga rata. Tambahkan kuning telur yang sudah dikeringkan sebanyak 5.625 g kedalam adonan sedikit demi sedikit sambil diaduk hingga bahan-bahan tersebut diatas tercampur dengan rata. Hasil adonan dibagi dua, setengah adonan dipersiapkan untuk pakan tinggi lemak yang dicampurkan ekstrak teh hijau, setengahnya lagi tanpa ekstrak teh hijau. Seluruh adonan dibentuk dengan panjang kurang lebih 3 cm dengan diameter 0,5 cm, diletakkan diatas seng dan dikeringkan langsung dibawah sinar matahari hingga kering (Gambar 7).
c. Diet Tinggi lemak dengan Ekstrak Teh Hijau
Setengah dari hasil adonan diet tinggi lemak yang telah dipisahkan, di aduk sedikit demi sedikit dengan ekstrak teh hijau sebanyak 2% (150 gr) sampai rata. Hasil adonan dibentuk dengan panjang kurang lebih 3 cm dengan diameter 0,5 cm, diletakkan diatas seng dan dikeringkan langsung dibawah sinar matahari hingga kering (Gambar 8)
d. Hewan Coba
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit (Mus musculus) Strain DD Webster, berjenis kelamin jantan, berumur 11 minggu dengan rata-rata berat badan 32 g yang diperoleh dari Laboratorium Penelitian Terpadu FMIPA Universitas Universitas Sumatera Utara Medan. Mencit akan dipelihara selama 6 minggu untuk penelitian ditambah dengan masa aklimatisasi selama 7 hari. Makanan yang diberikan adalah makanan tinggi lemak ditambah dengan 2 % ekstrak teh hijau untuk dua kelompok (9 ekor) dan 2 kelompok lainnya (9 ekor) diberikan makanan tinggi lemak tanpa penambahan ekstrak teh hijau. Minuman yang digunakan adalah air keran (tap water) yang diberikan secara ad libitum. Siklus terang gelap harian, temperatur dan kelembaban ruangan dibiarkan berada pada kisaran alamiah (Ropelle, et al., 2006). Kandang terbuat dari bahan plastik berukuran panjang 17 cm x lebar 12 cm x kedalaman 10 cm. Mencit dikandangkan satu ekor per kandang dengan tutup kawat halus dan pada tutup kandang dibentuk tempat pakan khusus. Dasar kandang dilapisi sekam padi setebal 0,5 – 1 cm. Kandang dibersihkan setiap hari dan sekam padi diganti setiap 2 (dua) hari.
e. Reagensia untuk Pengukuran profil lipid
- Kolesterol CHOD-PAP
- Trigliserida GPO-PAP
- Larutan Kolesterol standart
- Larutan trigliserida standart
- Larutan kolesterol HDL presipitat standart
3.3.2. Alat Penelitian
• Kolam untuk berenang mencit terbuat dari kaca dengan ukuran kolam adalah panjang 90 cm, lebar 45 cm dan dalam 45 cm.
• Oven merk Oxone untuk mengeringkan kuning telur.
• Termometer untuk mengukur suhu oven saat pengeringan kuning telur. • Spektrofotometer merk Microlab 300 (Jerman) untuk membaca sampel
pada panjang gelombang 546 nm
• Tabung reaksi digunakan sebagai tempat bahan pemeriksaan
• Spuit 3 cc digunakan untuk mengambil darah dari mencit percobaan
• Centrifuge digunakan sebagai pemutar sampel darah mencit untuk memisahkan sel darah dan serum.
• Clinic pet produksi biohit : Proline 10 – 250 μl, tip yellow untuk mengambil supernatant dan Proline 500 – 1000 μl, tip blue untuk mengambil reagen
• Inkubator digunakan untuk menginkubasi sampel sebelum pengukuran. • Timbangan untuk menimbang berat badan dan pakan mencit.
• Waterbath digunakan untuk menguapkan larutan teh hijau menjadi pasta • Freeze dried untuk mengeringkan pasta teh hijau