BAB VII.KESIMPULAN DAN SARAN
B. Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menelusuri pengaruh senyawa ini terhadap daur sel dengan mengamati ekspresi protein yang berperan dalam daur sel.
57
DAFTAR PUSTAKA
Afzal S., Asad M. K, Rumana Q. F, Ansari, Muhammad F. N, and Syed S. S. 2008. Redox Behavior of Anticancer Chalcone on a Glassy Carbon Electrode and Evaluation of its Interaction Parameters with DNA, Int. J. Mol. Sci. 2008, 9, 1424-1434
American Cancer Society, 2012, Cancer Facts and Figure 2012, Atlanta, American Cancer Society, Inc.: 1-6
Arianingrum, R., Arty, I.S., dan Atun S., 2010, “Uji Sitotoksisitas Senyawa Mono Para Hidroksi Kalkon terhadap Cancer cell lines T47D”, Saintek Jurnal, UNY
Arianingrum, R., Arty, I.S., dan Atun S., 2013, Kajian Potensi Senyawa Derivat Kalkon Bersubstituen Fluoro Sebagai Agen Ko-Kemoterapi Doxorubicin Pada Sel Kanker Leher Rahim Untuk Mengatasi Masalah Resistensi, Laporan Penelitian Fundamental 2013, LPPM, UNY.
Arianingrum, R., Hermawan, A., Meiyanto, E., and Purnomo, H., 2012, Molecular Docking Studies of Chalcone Derivate Compound MPHC A With Tyrosine Kinase Receptors, Proceeding in 24th Federation of Asian Pharmaceutical Associations Congress (FAPA) Bali, Indonesia on September 13 – 16.
Arty, I.S., 2009, “Synthesize and Citotoxicity Test of Several Compounds of Mono Para Hidroxy Chalcone”, Indo. J. Chem., 10 (1), 110-115
Arty, I.S., Arianingrum, R., dan Atun, S., 2012., Sintesis Senyawa Mono Para Hidroksi Kalkon Bersubstituen Bromo Dengan Katalis Asam dan Potensinya Sebagai Antioksidan dan Antikanker, Laporan Penelitian Guru Besar, LPPM.
Arty, I.S., Arianingrum, R., dan Atun, S., 2013, Sintesis Senyawa Mono Para Hidroksi Kalkon Bersubstituen Bromo Dengan Katalis Asam dan Potensinya Sebagai Antioksidan, Prosiding seminar Nasional Optimalisasi Penelitian dan PPM untu Pencerahan dan Kemandirian Bangsa, LPPM UNY.
Arty, S.A., Henk T, Samhudi, Sastrohamidjojo, and Henk an der Goot., 2000., Synthesis of benzylideneacetophenones and their inhibition of lipidperoxidation., Eur. J., Med. Chem. 35, 449-457
Boumendjel A, Ronot X, Boutonnat. 2009 . Chalcone derivatives acting as cell cycle blockers : potensial anticancer drugs ? J Curr Drug Targets. Apr;10(4):363-71. Boyer, M.J., and Tannock, I.F., 2005, The Basic Science of Oncology: Cellular
and Molecular Basis of Drug Treatment for Cancer, Mc Graw Hill Compay, forth edition, New York.
Davis, J.M., Navolanic, P.M., Weinstein-Oppenheimer, C.R., Steelman, L.S., Wei, H., Konopleva, M., Blagosklonny, M.V., and McCubrey, J.A., 2003,
58
“Raf-1 and Bcl-2 Induce Distinc and Common Pathways That Contribute to Breast Cancer Drug Resistantce”, Clin. Cancer Res.9:1161-1170. Departemen Kesehatan RI. (1997). Profil Kesehatan Indonesia. Depkes RI.
Jakarta
Ferreira, G.C., Epping, M., Kruyt, F.A.E., and Giaccone, G., 2008, “Apoptosis: Target of Cancer Therapy”, Clin. Cancer Research., 8: 2024-2034
Foster, J.S., Henley, D.C., Ahamed, S., and Wimalasena, J., 2001, “Estrogen and Cell Cycle Regulation in Breast Cancer”, Trend Endocr. Metab. 12(7):320-327
Gerl, R., and Vaux, D.L., 2005, Apoptosis in The Development and Treatment of Cancer, Carcin., 26 (2), 263-270.
Gondhowiardjo, S., 2004, Proliferasi Sel dan Keganasan, Majalah Kedokteran Indonesia, 54 (7), 289-299.
Hanhanan, D., and Wienberg, R.A., 2000, “The Hallmarks of Cancer”, Cell, 100, 57-70.
Hsu, Y.L., Kuo, P.L., Tzeng, W.W., and Lin, C.C., 2006, “Chalcone Inhibits the Proliferation of Human Breast Cancer Cell by Blocking Cell Cycle Progression and Inducing Apoptosis”, Food Chem Toxicol, 44 (5):704-13 IARC, 2010, IARC Launch the Devinitive Cancer Statistics Resource Globocon,
Press Release No 201., 1-2.
Kampa, M., Alexaki, Vassilia-Ismini., Notas, George., Nifli, Artemissia-Phoebe., Nistikaki, Anatassia., Hatzoglou, Anastassia., Bakogeorge, Efstathia, Koumtzoglou, Elena., Blekas, George., Boskou, Dimitrios., Gravanis, Achille., and Castanas, E., 2004, Antiproliferatif and Apoptotic Effect of Selective Phenolic Acids on T47D Human Breast Cancer Cells: Potential Mechanisms of Action., Breast Cancer Res, 6: R63-R74
King, R. J. B., 2000, Cancer Biology, Pearson Education, Second Edition, England. p.1-7,228-231, 263-264
Lee, Y.S.; Lim, S.S.; Shin, K.H.; Kim, Y.S.; Ohuchi, K.; Jung, S.H.2006. Anti-angiogenic and antitumoractivities of 2-hydroxy-4- methoxychalcone. Biol. Pharm. Bull. 29, 1028-1031.
Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S.L., Matsudaira, P, Baltimore, D., and Darnell, J., 2000, Molecular Cell Biology, 4th edition, New York: W.H. Freeman Matheny, C. J. M., Lamb, M. W., Brouwer, K. L. R., and Pollack, G. M., 2001,
“Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Implications of P-glycoprotein Modulation”, Pharmacotherapy, 21 (7), 778-796.
59
Mathivadani, P., Shanthi, P., and Sachdanandam, P., 2007, Apoptotic Effect of Semecarpus anacardium nut Extract on T47D Cancer Cell Line., Cell. Biol. Int., 31, 1198-1206
Meiyanto, E., 2002, Bahan Kuliah Biologi Molekuler: Signal Transduksi-Cell Cycle-Transposon, Proyek Que Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta. Petak, I., Houghton, Janet A., and Kopper, L., 2006, Molecular Targeting of Cell
Death Signal Transduction Pathways in Cancer, Current Signal Transduction Therapy, 1, 113-131Pahl, H.L., 1999, “Activators and Target Genes of Rel/NF-κB Transcription Factors”, Oncogene 18 6853–6866. Pines, J., 1997, Mammalian Cell Cycle, Oncogenes and Tumor Suppressors, IRL
Press, Oxford University Press, New York, 189-191.
Reynold, C.P., and Meurer, B.J., 2005, Evaluating Response to Antineoplastic Drug Combination in Tissue Culture Models, Methods Mol. Med., 110, 173-183
Sasayama, T.; Tanaka, K.; Mizukawa, K.; Kawamura, A.; Kondoh, T.; Hosoda, K.; Kohmura, E. 2007. Trans-4-lodo,4-boranyl-chalcone induces antitumor activity against malignant glioma cell lines in vitro and in vivo. J. Neu-Onc. 85, 123-132
Sen R. and Baltimore D., 1986, “Inducibility of Kappa Immunoglobulin Enhancer-Binding Protein Nf-kappa B by a Posttranslational Mechanism”, Cell, 1986 : 47, 921-8
Shen, K.H, Chang, JK, Hsu, Y.L, and Kuo, P.L., 2007, “Chalcone Arrests Cell Cycle Progression and Induces Apoptosis Through Induction Mitochondrial Pathway and Inhibition of Nuclear Faktor Kappa B Signaling in Human Bladder Cancer Cells”, Basic Clin Pharmacol Toxicol, 101 : 254-61
Singal, P.K., and Iliskovic, N., 1998, “Doxorubicin-induced Cardiomyopathy”, N. Engl. J. Med. 339:900-905
Teich, N. M., 1997, Oncogenes and Cancer in Franks, L.M. dan Teich, N.M., Cellular and Molecular Biology of Cancer, 3
rd
Edition, Oxford University Press, London.
Tjindarbumi, D. and Mangunkusumo, R., 2002, “Cancer in Indonesia, Present and Future”, Jpn. J. Clin. Oncol. 32 (Supplement 1): S17-21
Toshio M. Li-Bo W. ,Seikou N. , Kiyofumi N., Eri Y., Hisashi M., Osamu .M., Li-Jun W., and Masayuki Y., 2009., Medicinal Flowers. XXVII.1) New Flavanone and Chalcone Glycosides, Arenariumosides I, II, III, and IV, and Tumor Necrosis Factor-a Inhibitors from Everlasting, Flowers of Helichrysum arenarium, Chem. Pharm. Bull. 57(4) 361—367 (2009) Valeria, P., 2005, “Changes in P-Glycoprotein Activity Are Mediated by The
Growth of A Tumour Cell Line as Multicellular Spheroids”, Cancer Cell International, 5.
60
WHO, 2009, Cancer Control, Knowlendge into Action, WHO Guide for Effective Programes, www.who.int/cancer
Wong, H.L., Bendayan, R., Rauth, A.M., Xue, H.Y., Babakhanian, K., and Wu, X.Y., 2006, “A Mechanistic Study of Enhanced Doxorubicin Uptake and Retention in Multidrug Resistant Breast Cancer Cells Using A Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticle System”, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 317 (3), 1372-1381
World Health Organization. 1998. The World Health Report : live in the 21st century, A vision for all, WHO, Geneva
Wyllie, A., Donahue, V., Fischer, B., Hill, D., Keesey, J., and Manzow, S., 2000, Cell Death Apoptosis and Necrosis, Rosche Diagnostic Corporation Ye, C.L.; Liu, J.W.; Wei, D.Z.; Lu, Y.H.; Qian, F. 2005. In vivo antitumor activity
by 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5-dimethylchalcone in a solid human carcinoma xenograft model. Canc. Chemo.Pharm., 55, 447-452.
Ye, C.L.; Liu, J.W.; Wei, D.Z.; Lu, Y.H.; Qian, F.2004. In vitro anti-tumor activity of 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5-dimethylchalcone against six established human cancer cell lines. Pharmacol. Res. 2004, 50, 505-510
61 LAMPIRAN 1
Data Perhitungan Viabilitas Sel HeLa Perlakuan
Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
Konsentrasi (M)
Log Konsentrasi
Absorbansi Viabilitas Sel (%) Rerata
Standar Error 1 2 3 1 2 3 Viabilitas sel (%) 70 1,845 0,316 0,313 0,316 27,571 27,232 27,571 27,458 0,113 65 1,813 0,336 0,324 0,308 29,831 28,475 26,667 28,324 0,916 60 1,778 0,38 0,39 0,451 34,802 35,932 42,825 37,853 2,507 55 1,740 0,575 0,535 0,553 56,836 52,316 54,350 54,501 1,307 50 1,699 0,514 0,508 0,511 49,944 49,266 49,605 49,605 0,196 45 1,653 0,661 0,66 0,652 66,554 66,441 65,537 66,177 0,322 40 1,602 0,634 0,635 0,632 63,503 63,616 63,277 63,465 0,100 35 1,544 0,675 0,671 0,645 68,136 67,684 64,746 66,855 1,063 30 1,477 0,834 0,742 0,848 86,102 75,706 87,684 83,164 3,757 25 1,398 0,875 0,895 0,918 90,734 92,994 95,593 93,107 1,404 20 1,301 0,937 0,915 0,924 97,740 95,254 96,271 96,422 0,722 Kontrol Sel 0,955 0,955 0,960 Kontrol Media 0,071 0,914 0,073
Harga koefisien determinasi (r2) perhitungan = 0,942, r = 0,9706. Harga r tabel untuk taraf kesalahan 5%, n=11 adalah 0,602.
r hitung> r tabel, sehingga nilai IC 50 dapat dihitung dari persamaan tersebut : y = -131,64x + 274,26
50= -131,64x + 274,26 x = 1,7036 , IC50 = in log x IC50 = 50 M
62 LAMPIRAN 2
Data Perhitungan Efek Penghambatan Proliferasi Sel HeLa Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
Jumlah sel HeLa pada pengamatan jam 24, 48, dan 72 dengan perlakuan BHM 12,5; 25; 50; dan 75 M dan tanpa perlakuan (kontrol)
Jam Kontrol Kadar BHM (mM)
75 50 25 12,5
1 2 3 4
JUMLAH SEL RATA-RATA
0 5000,000 4918,033 4726,776 4904,372 5373,406
24 12504,554 268,670 1261,416 2818,761 5159,381
48 11404,110 51,370 1261,416 2568,493 9731,735
72 13515,982 268,265 222,603 656,393 9880,137
Jam Kontrol Kadar BHM (mM)
75 50 25 12,5
1 2 3 4
LOG JUMLAH SEL RATA-RATA
0 3,699 3,692 3,675 3,691 3,730
24 4,097 2,429 3,101 3,450 3,713
48 4,057 1,711 3,101 3,410 3,988
63
Jam Kontrol Kadar BHM (M)
75 50 25 12,5
JUMLAH SEL RATA-RATA X 104
sel 2 x lipat 10000 9836 9454 9809 10747
Log jumlah sel 4,000 3,993 3,976 3,992 4,031
Doubling time 37,000 74
Perlakuan Persamaan garis Slope Nilai Doubling Time (Jam)
Kontrol y = 0,0052x + 3,8076 0,0052 37,000
BHM 12,5 M y = 0,0045x + 3,6961 0,0045 74,000
BHM 25 M y = -0,0111x + 3,741 -0,0111 -
BHM 50 M y = -0,0166x + 3,6531 -0,0166 -
64 LAMPIRAN 3
Data Perhitungan Viabilitas Sel HeLa Perlakuan Doksorubisin
Konsentrasi (M)
Log Konsentrasi
Absorbansi Viabilitas Sel (%) Rerata
Standar Error 1 2 3 1 2 3 Viabilitas sel (%) 75 1,875 0,169 0,175 0,120 15,83 16,83 7,67 13,44 2,903 50 1,699 0,209 0,231 0,215 22,50 26,17 23,50 24,06 1,094 25 1,398 0,257 0,265 0,270 30,50 31,83 32,67 31,67 0,631 12,5 1,097 0,378 0,377 0,375 50,67 50,50 50,17 50,44 0,147 10 1,000 0,400 0,361 0,370 54,33 47,83 49,33 50,50 1,965 5 0,699 0,390 0,378 0,363 52,67 50,67 48,17 50,50 1,302 2,5 0,398 0,410 0,408 0,410 56,00 55,67 56,00 55,89 0,111 1 0,000 0,490 0,462 0,449 69,33 64,67 62,50 65,50 2,016 0,5 -0,301 0,576 0,603 0,507 83,67 88,17 72,17 81,33 4,764 0,25 -0,602 0,615 0,600 0,622 90,17 87,67 91,33 89,72 1,082 0,125 -0,903 0,624 0,646 0,626 91,67 95,33 92,00 93,00 1,171 Kontrol Media 0,076 0,073 0,072 0,074 Kontrol Sel 0,681 0,669 0,671 0,674
Harga koefisien determinasi (r2) perhitungan = 0,9639, r = 0,9818. Harga r tabel untuk taraf kesalahan 5%, n=11 adalah 0,602.
r hitung> r tabel, sehingga nilai IC 50 dapat dihitung dari persamaan tersebut : y = -27,182x + 70,811
50 = -27,182x + 70,811 x = 52,08, IC50 = in log x IC50 = 6 M
65 LAMPIRAN 4
Uji Sitotoksik Kombinasi Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada Sel HeLa
Variasi Konsentrasi :
IC50 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (BHM): 50M
IC50 Doksorubisin : 6M 1/16 1/8 1/4 1/2 BHM (M) 3,125 6,25 12,5 25 Dox ((M) 0,375 0,75 1,5 3 A. Viabilitas Sel BHM(M) Dox(M) 0 0,375 0,75 1,5 3 0 100 72,39 69,05 58,55 50,09 3,125 95,80 67,39 63,87 58,12 51,20 6,25 96,85 64,73 67,14 57,07 47,87 12,5 80,54 53,55 53,86 26,87 11,12 25 50,71 9,20 5,93 5,99 5,44
Persamaan Garis Lurus :
Doksorubisin : y = -27,182 + 70,811 (x = log konsentrasi) BHM : y = -131,64x + 274,26 (x = log konsentrasi) B. Konsentrasi Doksorubisin Tunggal
0,375 0,75 1,5 3 3,125 1,336 1,801 2,930 5,264 6,25 1,674 1,365 3,202 6,983 12,5 4,315 4,203 41,362 157,054 25 184,711 243,739 242,467 254,158 C. Konsentrasi BHM Tunggal 0,375 0,75 1,5 3 3,125 37,282 39,650 43,841 49,481 6,25 39,055 37,444 44,654 52,453 12,5 47,490 47,235 75,736 99,759 25 103,157 109,236 109,118 110,184 D. Combination Index 0,375 0,75 1,5 3 3,125 0,364 0,495 0,583 0,633 6,25 0,384 0,716 0,608 0,549 12,5 0,350 0,443 0,201 0,144 25 0,244 0,232 0,235 0,239
66 LAMPIRAN 5
Data Perhitungan Viabilitas Sel T47D Perlakuan
Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
Konsentrasi (M)
Absorbansi Viabilitas Sel (%) Rerata
Standar Error 1 2 3 1 2 3 Viabilitas sel (%) 80 0,142 0,144 0,131 8,70 8,95 7,29 8,31 0,517 60 0,320 0,320 0,361 31,46 31,46 36,70 33,21 1,748 40 0,529 0,494 0,512 58,18 53,71 56,01 55,97 1,292 20 0,738 0,708 0,696 84,91 81,07 79,54 81,84 1,597 10 0,741 0,750 0,802 85,29 86,45 93,09 88,28 2,431 5 0,796 0,784 0,779 92,33 90,79 90,15 91,09 0,645 Kontrol Sel 0,854 0,851 0,863 0,856 Kontrol Media 0,074 0,074 0,074 0,074
Harga koefisien determinasi (r2) perhitungan = 0,994, r = 0,997. Harga r tabel untuk taraf kesalahan 5%, n=6 adalah 0,811.
r hitung> r tabel, sehingga nilai IC 50 dapat dihitung dari persamaan tersebut : y = -1,127x + 100,17
50= -1,127x + 100,17 x = 45
67 LAMPIRAN 6
Data Perhitungan Efek Penghambatan Proliferasi Sel T47D Perlakuan Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on Jumlah sel T47D pada pengamatan jam 24, 48, dan 72 dengan perlakuan senyawa BHM dan tanpa perlakuan (kontrol)
Jam Kontrol Kadar BHM (mM)
67,5 45 22,5 11,25
1 2 3 4
JUMLAH SEL RATA-RATA
0 5000,000 5399,543 5045,662 5097,032 5079,909
24 13401,826 428,082 2106,164 4914,384 9452,055
48 13858,447 507,991 2106,164 7551,370 12888,128
72 11883,562 205,479 313,927 1906,393 10724,886
Jam Kontrol Kadar BHM (M)
67,5 45 22,5 11,25
1 2 3 4
LOG JUMLAH SEL RATA-RATA
0 3,699 3,732 3,703 3,707 3,706
24 4,127 2,632 3,323 3,691 3,976
48 4,142 2,706 3,323 3,878 4,110
68
Jam Kontrol Kadar BHM (M)
67,5 45 22,5 11
JUMLAH SEL RATA-RATA X 104
sel 2 x lipat 10000 10799 10091 10194 10160
Log jumlah sel 4,000 4,033 4,004 4,008 4,007
Doubling time 33,479 47
Perlakuan Persamaan garis Slope Nilai Doubling Time (Jam)
Kontrol y = 0,0048x + 3,8393 0,0048 33,479 BHM 11,25 M y = 0,0046x + 3,7893 0,0046 47,000 BHM 22,5 M y = -0,0046x + 3,8035 -0,0046 BHM 45 M y = -0,0151x +3,7544 -0,0151 - BHM 67,5 M y = -0,0174x + 3,4733 -0,0174 -
69 LAMPIRAN 7
Data Perhitungan Viabilitas Sel T47D Perlakuan Doksorubisin
Konsentrasi (nM)
Absorbansi Viabilitas Sel (%) Rerata
Standar Error 1 2 3 1 2 3 Viabilitas sel (%) 250 0,349 0,367 0,354 35,90 38,30 36,57 36,92 0,713 225 0,399 0,395 0,399 42,55 42,02 42,55 42,38 0,177 200 0,387 0,391 0,391 40,96 41,49 41,49 41,31 0,177 175 0,490 0,483 0,486 54,65 53,72 54,12 54,17 0,270 150 0,516 0,515 0,520 58,11 57,98 58,64 58,24 0,203 125 0,538 0,570 0,553 61,04 65,29 63,03 63,12 1,229 100 0,570 0,553 0,559 65,29 63,03 63,83 64,05 0,662 75 0,707 0,660 0,700 83,51 77,26 82,58 81,12 1,947 50 0,702 0,702 0,742 82,85 82,85 88,16 84,62 1,773 Kontrol Sel 0,817 0,832 0,844 0,831 Kontrol Media 0,081 0,079 0,078 0,079
Harga koefisien determinasi (r2) perhitungan = 0,9526, r = 0,9760. Harga r tabel untuk taraf kesalahan 5%, n=9 adalah 0,666.
r hitung> r tabel, sehingga nilai IC 50 dapat dihitung dari persamaan tersebut : y = -0,241x + 94,58
50 =-0,241x + 94,58 x = 185
70 LAMPIRAN 8
Uji Sitotoksik Kombinasi Senyawa 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan Doksorubisin pada Sel T47D
Variasi Konsentrasi :
IC50 1-(4’-bromofenil) -3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (BHM): 45M
IC50 Doksorubisin : 185 nM 1/16 1/8 1/4 1/2 BHM (M) 2,8125 5,625 11,25 22,5 Dox (nM) 11,5625 23,125 46,25 92,5 E. Viabilitas Sel BHM(M) Dox(nM) 0 11,5625 23,125 46,25 92,65 0 100 99,34 96,01 70,67 49,12 2,8125 96,62 98,38 87,18 67,95 33,87 5,625 93,34 84,25 85,31 63,15 28,37 11,25 81,07 71,33 61,33 36,65 5,50 22,5 49,67 46,74 26,35 9,39 5,15
Persamaan Garis Lurus :
Doksorubisin : y = -0,241x + 94,58 (x = konsentrasi) BHM : y = -1,127x + 100,17 (x = konsentrasi) F. Konsentrasi Doksorubisin Tunggal
11,5625 23,125 46,25 92,65 2,8125 -15,79 30,71 110,52 251,90 5,625 42,86 38,46 130,42 274,73 11,25 96,48 137,96 240,38 369,62 22,5 198,49 283,11 353,49 371,08 G. Konsentrasi BHM Tunggal 11,5625 23,125 46,25 92,65 2,8125 1,584 11,528 28,593 58,827 5,625 14,126 13,185 32,848 63,709 11,25 25,592 34,461 56,364 84,000 22,5 47,405 65,501 80,551 84,313 H. Combination Index 11,5625 23,125 46,25 92,65 2,8125 1,043 0,997 0,517 0,416 5,625 0,668 1,028 0,526 0,426 11,25 0,559 0,494 0,392 0,385 22,5 0,533 0,425 0,410 0,517
71 LAMPIRAN 9
Personalia Tenaga Peneliti
Personalia yang terlibat dalam kegiatan ini adalah : No. Nama/NID Instansi Asal Bidang
Ilmu
Alokasi Waktu
(jam/minggu)
Urain Tugas
1. Retno Arianingrum, M.Si /0015126803
FMIPA UNY Biokimia 15 Jam Ketua
Uji sitotoksik Uji aktivitas pemacuan apoptosis Uji Pengamatan Daur Sel Uji Ekspresi Protein 2. Prof. Dr. Indyah Sulistyo
Arty, M.S /0006045104
FMIPA UNY Kimia Organik Farmasi
10 Jam Anggota Uji sitotoksik
72
Publikasi pada “International Conference ICB Pharma II “Current Breakthrough in Pharmacy Material and Analyses”
74
Draf Paten Deskripsi
PENGGUNAAN KOMBINASI DERIVAT KALKON BERSUBSTSITUEN BROMO DAN DOKSORUBISIN PADA PENGOBATAN KANKER PAYUDARA
Bidang Teknik Invensi :
Invensi ini berhubungan dengan penggunaan senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on tunggal dan kombinasinya dengan agen ko-kemoterapi doksorubisin sebagai antikanker pada sel kanker payudara.
Latar Belakang Invensi
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker penyebab kematian di dunia setelah kanker paru-paru, perut, hepar, dan kolon dengan insidensi sebesar 502.000 kasus (WHO, 2006). Di Indonesia, pravalensi kanker payudara menduduki peringkat ke-2 setelah kanker leher rahim dan merupakan penyebab kematian utama pada wanita. Dari semua kasus kanker pada wanita Indonesia, pada tahun 1991 kasus kanker payudara mencapai 17,77% (Tjindarbumi and Mangunkusumo, 2002).
Beberapa metode untuk pengobatan kanker telah dilakukan, diantaranya pembedahan, kemoterapi dan penyinaran (radiasi). Namun, masing-masing metode mempunyai kelemahan, sehingga tingkat keberhasilannya masih rendah (King, 2000). Kegagalan yang sering terjadi pada pengobatan melalui kemoterapi disebabkan karena rendahnya selektivitas obat anti kanker dan adanya fenomena resistensi sel kanker terhadap agen kemoterapi (drug-resistence) (Wong et al., 2006). Oleh karena itu, pengembangan dan penemuan pengobatan
kanker,khususnya kanker payudara perlu terus
75
Diantara agen kemoterapi kanker yang telah menimbulkan resistensi adalah doksorubisin. Senyawa golongan antrasiklin ini diberikan pada berbagai jenis kanker. Selain menimbulkan resistensi, doksorubisin dapat menyebabkan kardiotoksisitas pada penggunaan jangka panjang (Ferreira et al., 2008). Salah satu alternatif untuk mengatasi resistensi adalah kombinasi agen kemoterapi dengan agen kemopreventif sehingga dapat meningkatkan keberhasilan terapi.
Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) adalah jenis keton dengan ikatan tidak jenuh yang telah banyak di teliti sebagai senyawa terapetika, khususnya sebagai obat antitumor. Oleh karena aktivitasnya sebagai ”high therapeutic index”, kalkon di anggap sebagai ”the new era of medicines” dalam kapasitasnya sebagai antitumor, antibakterial, dan anti-inflamatory (Afzal et al., 2008). Disebutkan pula bahwa sebagian besar target utama dari senyawa-senyawa kalkon adalah mempengaruhi daur sel (Boumendjel et al., 2009). Shen et al, 2007 telah membuktikan bahwa struktur dasar kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) mampu menghambat aktivasi nuclear factor kappa (NF-B). Penghambatan aktivasi NF-B
tersebut menyebabkan adanya induksi apoptosis,
penghambatan siklus sel, dan menurunkan ekspresi Bcl-XL sebagai downstream target dari NF-B pada kultur sel kanker kandung kemih T24 dan HT-1376, serta sel payudara MCF-7 dan MDA-MB-231 (Hsu et al., 2006). Beberapa senyawa derivat kalkon yang mengandung gugus hidroksi pada posisi para seperti broussochalcone A;
xanthoangelol D; butein; isoliquiritigenin;
licochalcone A; isoliquiritigenin 2’-metil eter, dan xanthohumol juga mampu menghambat aktivasi NF-B (Yadav
76 et al., 2011).
Penelusuran terhadap beberapa paten menunjukkan bahwa beberapa derivat kalkon telah digunakan dalam pengobatan kanker, seperti pada United States Patent US
6,498,195 B2 “Use of
1-Propanone-1-(2,4-dihydroxyphenyl)-3-hydroxy-hydroxyphenyl as
anticarcinogenic agent”, United States Patent US 7,872,029 B2 “Chalcone and its analogs as agent for the inhibition of angiogenesis and related disease states”.
Arty et al., (2013), telah mensintesis senyawa derivat kalkon bersubtituen bromo, yaitu 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on (Gambar 1). Senyawa ini terbukti memiliki aktivitas
antioksidan yang tinggi dan berpotensi sebagai
antikanker pada sel kanker leher rahim.
Invensi ini menggunakan senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on baik tunggal maupun kombinasinya dengan agen ko-kemoterapi doksorubisin sebagai antikanker pada sel kanker payudara T47D. Pengujian sebagai antikanker dilakukan dengan uji sitotoksik menggunakan MTT
{3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium
bromida}. Perhitungan sitotoksisitas kombinasi
digunakan Combination Index (CI) (Reynols and
Maurer,2005).
Ringkasan Invensi
Penggunaan senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebagai
antikanker baik secara tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin ini dilakukan untuk menghasilkan dosis yang efektif dalam mematikan sel kanker payudara.
77
Penggunaan senyawa ini dalam treatment meliputi tahapan berikut:
a. Preparasi senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan
doksorubisin (produk Kalbe Farma) untuk uji aktivitas sitotoksik dimana senyawa tersebut dilarutkan dalam DMSO (Dimetilsulfoksida).
b. Pengujian aktivitas sitotoksik senyawa baik tunggal maupun kombinasinya dengan doksorubisin terhadap sel T47D (ATCC) menggunakan metode MTT
dan perhitungan kombinasi dosis efektif
menggunakan Combination Index (CI) (Reynols and Maurer,2005).
Uraian Singkat Gambar
Gambar 1 memperlihatkan struktur senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on atau 3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1-fenil-2-propen-1-on).
Gambar 2 memperlihatkan hubungan konsentrasi senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan % viabilitas sel T47D
Gambar 3 memperlihatkan hubungan konsentrasi doksorubisin dengan % viabilitas sel T47D
Uraian Lengkap Invensi
a. Preparasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on
Senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dilarutkan dalam pelarut DMSO hingga konsentrasi 100.000 mikromolar sebagai larutan induk. Selanjutnya dibuat variasi konsentrasi
78
5; 10; 20; 40; 60; dan 80 mikromolar dengan menggunakan media kultur (MK). Media kultur yang digunakan dibuat dari: (1) Penisilin-streptomisin (Penstrep) 2%. (2) Fetal Bovine Serum (FBS) 10%, dan (3) Fungizon 0,5% dilarutkan hingga 100 ml dengan medium Rosewell Park Memorial Institut (RPMI) 1640 (GIBCO BRL) yang dibuat dengan melarutkan 10,4 g RPMI ditambah NaHCO3 2,2 g; Hepes 2 g dilarutkan dengan akuabides steril dan dikondisikan pada pH 7,2 – 7,4, ditambahkan akuades hingga volume akhir 1 liter. Selanjutnya disterilisasi dengan filter 0,2 mikron.
Senyawa doksorubisin dilarutkan dengan media kultur yang sama dengan variasi konsentrasi 50; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 225 dan 250 nanomolar. Variasi konsentrasi senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on yang digunakan untuk
kombinasi sebesar : 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 mikromolar, sedangkan konsentrasi doksorubisin sebesar : 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar.
b. Uji aktivitas sebagai antikanker pada sel kanker payudara
Sel dengan konsentrasi 1 x 104 sel/sumuran
didistribusikan ke dalam plate 96 sumuran dan diinkubasi selama 24 jam untuk beradaptasi dan menempel di sumuran. Keesokannya media diambil kemudian ditambahkan 100 μl media kultur yang
mengandung DMSO 0,1% (kontrol) atau sampel, inkubasi selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media kultur yang mengandung sampel dibuang, dicuci dengan 100 mikroliter PBS (Phospate Buffer Saline). Kemudian ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 100 mikroliter media kultur yang mengandung MTT 5 mg/ml, inkubasi lagi selama 4 jam
79
pada suhu 37°C. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Setelah 4 jam, media yang mengandung MTT dibuang, kemudian ditambahkan larutan SDS untuk melarutkan kristal formazan. Digoyang di atas shaker selama 10 menit kemudian dibaca dengan dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.
Data yang diperoleh pembacaan ELISA reader berupa absorbansi masing-masing sumuran dikonversi ke dalam persen viabilitas sel. Persentase viabilitas sel dihitung menggunakan rumus:
Absorbansi sel dengan perlakuan-absorbansi kontrol media X 100% Absorbansi kontrol sel – absorbansi kontrol media
Data yang berupa viabilitas sel kemudian dianalisis dengan membuat grafik log konsentrasi versus viabilitas sel. Nilai IC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan penghambatan pertumbuhan 50% dari populasi sel sehingga dapat diketahui potensi sitotoksisitasnya (Doyle and Griffiths, 2000).
Sitotoksik kombinasi ditetapkan dengan menghitung indeks interaksi antara doksorubisin dengan senyawa 1- (4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on menggunakan persamaan :
Combination Index/CI = (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2 D1 dan D2 adalah konsentrasi sampel yang digunakan dalam perlakuan kombinasi. (Dx)1 dan (Dx)2 adalah konsentrasi tunggal yang dapat menghasilkan efek
sebesar yang ditimbulkan perlakuan kombinasi (Reynols and Maurer,2005). Angka CI yang diperoleh
diinterpretasikan sebagaimana Tabel 1.
Potensi ketoksikan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel
80
T47D disajikan pada Gambar 3, yaitu memiliki nilai IC50
sebesar 45 mikromolar yang berarti sangat aktif. Sedangkan potensi ketoksikan doksorubisin disajikan
pada Gambar 4, memiliki nilai IC50 sebesar 185
nanomolar.
Tabel 1. Interpretasi Nilai Indeks Kombinasi (CI)
Nilai CI Interpretasi
< 0,1 sinergi sangat kuat
0,1 - 0,3 sinergis kuat 0,3 - 0,7 sinergis 0,7 - 0,9 sinergis ringan-sedang 0,9 - 1,1 mendekati aditif 1,1 - 1,45 antagonis ringan-sedang 1,45 - 3,3 antagonis
> 3,3 antagonis kuat-sangat kuat
(Reynols and Maurer,2005)
Uji sitotoksik kombinasi doksorubisin dan
senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap sel T47D pada konsentrasi senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 mikromolar, sedangkan konsentrasi doksorubisin sebesar : 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar. Kombinasi kedua senyawa ini mampu menurunkan viabilitas sel lebih rendah daripada penggunaan senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on maupun doksorubisin secara tunggal
81
Tabel 2. Persen viabilitas sel perlakuan kombinasi
senyawa
1-4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan doksorubisin pada berbagai variasi konsentrasi.
Viabilitas sel (%) pada variasi konsentrasi: 1-4’- bromofenil)-3- (4-hidroksi-3- metoksifenil)-2-propen-1-on (M) Doksorubisin (nM) 0 11,5625 23,125 46,25 92,65 0 100 99,34 96,01 70,67 49,12 2,8125 96,62 98,38 87,18 67,95 33,87 5,625 93,34 84,25 85,31 63,15 28,37 11,25 81,07 71,33 61,33 36,65 5,50 22,5 49,67 46,74 26,35 9,39 5,15
Berdasarkan perhitungan nilai CI (Tabel 3),
terlihat bahwa pada kombinasi senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dengan konsentrasi sebesar 2,8125; 5,625; 11,25; dan 22,5 mikromolar, dan konsentrasi doksorubisin sebesar : 11,5625; 23,125; 46,25; dan 92,5 nanomolar memberikan interprestasi antara mendekati aditif (0,9 – 1,1) pada konsentrasi kombinasi rendah dan sinergi (0,3-0,7). Dari hasil ini membuktikan bahwa senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on berpotensi untuk digunakan sebagai agen ko-kemoterapi doksorubisin pada pengobatan kanker payudara. Kombinasi yang efektif dalam mematikan sel T47D adalah pada penggunaan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 11,25 mikromolar dan doksorubisin sebesar 92,65 nanomolar.
82
Tabel 3. Hasil perhitungan nilai CI pada perlakuan
kombinasi senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksi-fenil)-2-propen-1-on dan
doksorubisin pada berbagai variasi
konsentrasi.
Nilai CI pada perlakuan kombinasi: 1-4’-bromofenil)-3- (4-hidroksi-3- metoksifenil)-2-propen-1-on (M) Doksorubisin (nanomolar) 11,5625 23,125 46,25 92,65 2,8125 1,0 1,0 0,5 0,4 5,625 0,7 1,0 0,5 0,4 11,25 0,6 0,5 0,4 0,4 22,5 0,5 0,4 0,4 0,5
83 Klaim
1. Penggunaan senyawa
1-4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebagai antikanker
pada sel kanker payudara T47D dengan IC50 sebesar 45 mikromolar.
2. Penggunaan kombinasi senyawa
1-4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar
11,25 mikromolar dan doksorubisin sebesar 92,65 nanomolar sebagai antikanker pada sel payudara.
84 Abstrak
PENGGUNAAN KOMBINASI DERIVAT KALKON BERSUBSTSITUEN BROMO DAN DOKSORUBISIN PADA PENGOBATAN KANKER
PAYUDARA
Invensi ini berhubungan dengan penggunaan senyawa
derivat kalkon
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on baik tunggal dan
kombinasinya dengan agen ko-kemoterapi doksorubisin sebagai antikanker pada sel kanker payudara T47D.
Senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on dan doksorubisin
dilarutkan dalam media kultur yang mengandung DMSO. Senyawa ini secara tunggal dapat digunakan sebagai antikanker dengan IC50 sebesar 45 mikromolar, dan dikombinasikan dengan doksorubisin dengan dosis efektif
pada penggunaan senyawa
1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on sebesar 11,25 mikromolar dan doksorubisin sebesar 92,65 nanomolar.
85 Gambar 1 Gambar 2 Gambar 3 HO HO F O CH3O Br IC50 = 45 M IC50 = 185 nM
86
Manuscripts for Asian Pasific Journal of Tropical Biomediicine
Cytotoxic and apoptotic effects of a chalcones derivative with
bromo substituent on HeLa cells
Retno Arianingrum*, Indyah Sulistyo Arty
Department of Chemistry Education, Faculty of Mathematics and Natural Science, Universitas Negeri Yogyakarta, Yogyakarta, Indonesia
ABSTRACT
Objective: To investigate the cytotoxic effect, apoptosis induction, and Bcl-2 expression of a chalcone derivate 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on against human cervix cancer HeLa cell lines. Methods:
The cytotoxic effect was analyzed using MTT [3-(4,5 dimethyltiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoilium bromide] assay, the apoptotic effect was determined by Annexin-V flowcytometry method, and the expression of Bcl-2 was identified using immunocytochemistry method.
Results: The research results showed that the IC50 of 1-(4’-bromophenyl) -3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on was 53 M, and it increased the apoptotic induction and decreased the Bcl-2 expression level.
Conclusion: According to the result, this compound is potential to be developed as chemotherapeutic agent for cervix cancer by inducing apoptosis.
Keywords: 1-(4’-bromophenyl)-3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-propene-1-on ,cytotoxic effect, apoptosis induction, Bcl-2 expression, HeLa cancer cells
1. Introduction
Cancer is the second most fatal disease after heart attack. Cervix cancer is one type of cancer that has high prevalence and the first most common cancer worldwide which causes mortality [1]. In Indonesia, cervical cancer is the first most frequent one in women [2]. Current cancer therapies (surgery, radiation, immunotherapy, and chemo-therapy) [3] lead to undesired physical and psychological distress to the patients. So that researches on finding new anticancer compounds that have better therapeutic efficacy and fewer side-effects are still needed.
Chalcones (trans-1,3-diaryl-2-propen-1-ones)4, a biosynthetic product of the shikimate pathway, belonging to the flavonoid family are precursors of open chain flavonoids and isoflavonoids, which are abundant in edible plants. Synthetic chalcones can be prepared by an aldol condensation between a benzaldehyde and acetophenone in the presence of strong bases. There are also some reports of acid-catalyzed aldol condensations5. Chalcones and their derivates have attracted increasing attention due to their numerous pharmacological applications. They have displayed a broad spectrum of pharmacological activities, one of them being