BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN
5.2 Saran
a. Diharapkan dapat dilakukan analisis kuantitatif untuk mendapatkan informasi jumlah DNA atau konsentrasi cemaran daging babi pada produk bakso sapi.
b. Perlu di lakukan pencarian dan percobaan dengan primer baru dengan urutan basa yang lebih spesifik dan benar-benar tidak memiliki kesamaan dengan spesies apapun selain spesies yang diharapkan.
c. Diharapkan dapat dilakukan pengembangan lebih lanjut terutama terkait metode isolasi, metode amplifikasi dan metode analisis yang lebih efektif dan efisien yang kedepannya dapat dijadikan sebagai rujukan utama pengujian kehalalan produk bakso.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Alaraidh, Ibrahim Abdullah. 2008. Improved DNA Extraction Method for Porcine Contaminants, Detection in Imported Meat to The Saudi Market. Saudi Journal of Biological Sciences 15 (2): 225-229
Antaranews. 2015. Polisi ungkap bakso daging celeng di Sukabumi. Hukum. Via
http://antaranews.com diakses pada 13 Mei 2015
BioDrop. 2015. Quick Start Guide. http://www.biodrop.co.uk. Diakses pada tanggal 13 April 2015 pukul 10.04
BioRad. 2006. Real-Time PCR Application Guide. http://bio-rad.com. Diakses pada tanggal 28 Mei 2015 pukul 15.22
Brooks, Randy. 2003. Basic Principle of Biology. BarCharts,Inc.
http://quickstudy.com diakses tanggal 28 Mei 2015 Pukul 15.20
Burns, Malcolm J., Gavin J Nixon., Carole A Foy., Neil Harris. 2005.
Standardisation of data from real-time quantitative PCR methods –
evaluation of outliers and comparison of calibration curves. BMC Biotecnology doi.10.1186/1472-6750-5-31
Cain, Michael L. 2002. Discover Biology Second Edition. W. W. Norton & Co. And Sumana Inc.
Calvo, J.H P.Zaragoza dan R.Osta. 2001. Technical Note: A quick and more sensitive method to identify pork in processed and unprocessed food by PCR amplification of a new specific DNA fragmen. Journal of Animal Science. American Society of Animal Science. 79:2108-2112, 2001
Dewan Standardisasi Nasional. 1995. SNI 01-3818, Bakso Daging. Dewan Standarisasi Nasional, Jakarta.
Departemen Agama RI. 2014. Al Hikmah Al-Qur’an dan Terjemahannya.
Bandung: CV.Diponegoro.
Detik. 2012. Kasus Bakso Babi, Pedagang Bakso Khawatir Dagangan Tak Laku.
Detik Finance via http://detik.com. Diakses pada 13 Mei 2015
Gaffar, Shabrani, M.Si. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: FMIPA-Universitas Padjajaran.
Izzah, Afifah Nurul. 2014. Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin Babi dengan Menggunakan Real Time PCR. SKRIPSI. Program Studi
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
Jain, Shally. 2004, Use Of Cytochrome B Gene Variability In Detecting Meat Species By Multiplex PCR Assay, Department Of Veterinary Public Health, College Of Veterinary Science & Animal Husbandry, Anand Agricultural University, Anand.
Jambi Independent. 2010. Bakso Arema di Campur Babi. Via
http://issuu.com/jambi-independent/. diakses pada tanggal 29 Mei 2015
JPNN. 2015. Ngakunya Dagang Sapi Impor, Ternyata Jualan Bakso Daging Babi. Kriminal. Via http://jpnn.com. Diakses pada tanggal 13 Mei 2015
Pusat Bahasa Depdiknas. 2008. Kamus Besar Bahasa Indonesia. Jakarta. ISBN 978-979-689-779-1
Koolman, Jan dan Klaus-Heinrich Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry.
Edisi kelima. Germany: Georg Thieme Verlag.
Lopez-Andreo, Mario, Laura Lugo., A Garrido-Pertierra., M. Isabel Prieto and A Puyet. 2005. Identification and quantitation of species in complex DNA mixtures by real-time polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 339(1), 73-82Bio-Rad. 2006. Real-time PCR Application Guide.
http://www.bio-rad.com. Diakses pada 20 Juli 2011
Margawati, Endang Tri., Muhamad Ridwan. 2010. Pengujian Pencemaran Daging Babi Pada Beberapa Produk Bakso Dengan Teknologi PCR: Pencarian Sistem Pengujian Efektif. Bogor : Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI.
Muladno, 2010. Teknologi Rekayasa Genetik. Edisi Kedua. Bogor : IPB Press. NanoDrop, 2007. ND-1000 Spectrophotometer V3.5 User’s Manual.
http://nanodrop.com Diakses pada 13 April 2015 pukul 11.00
National Human Genome Research Institute. 2010. Nucleic Acid.
http://genome.gov. Diakses pada 28 Mei 2015 pukul 13.00
Okezone. 2010. Paguyuban Pedagang Bakso Palembang Resah. Via
http://okezone.com. Diakses pada 1 Juni 2014
Passarge, Ebenhard. 2007. Color Atlas of Genetics.Edisi ketiga. New York: Theime.
Purnomo, Bambang. 2004. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Bengkulu: Universitas Bengkulu Press.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Rahmawati, Putri. 2012. Analisis Cemaran daging Babi pada Produk Dendeng Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat dengan Metode Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR. SKRIPSI. Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
Rochea. 2008. The LightCycler® 480 Instrument Operator’s Manual.
http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 13 April 2015 pukul 09.55
Rocheb. 2012. High Pure PCR Template Preparation Kit.. http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 13 April 2015 pukul 10.00
Rochec. 2008. LightCycler® 480 Probes Master. Version February 2008.
http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 13 April 2015 pukul 10.05
Roched. 2012. The LightCycler® 480 System Unleash the Potential of Real-Time PCR. http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 13 April 2015 pukul 10.03
Saddam S, Muh. 2013. Pengaruh Pemberian Asap Cair dengan Lama Penyimpanan Berbeda Terhadap Jumlah Bakteri dan Organoleptik Daging Sapi. SKRIPSI. Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin Makasar.
Saiyed. Z.M., C.N. Ramchand. 2007. Extraction of Genomic DNA Using Magnetic Nanoparticle (Fe3O4) as Solid-Phase Support. American Journal of Infectious Disease 3 (4): 225-229, 2007
Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A Labolatory Manual. 2nd edition. New York : Cold Spring Harbour Laboratory Press. Book 1.6.1 – 6.17
Sindo. 2014. Bakso oplosan di Tambora diteliti selama seminggu. MetroNews Via http://sindonews.com. Diakses pada 13 Mei 2015
Solihin, Dedy Duryadi. 1994. Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA) dalam Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan. Bogor : FMIPA IPB. ISSN 0854-8587
Sulistyaningsih, Erma. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru Diagnosis dan Manajemen Penyakit Infeksi. Jember : Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember.
Tanabe, Soichi., Makiko Hase., Takeo Yano., Masahiko Sato., Tasuya Fujimura., and Hiroshi Akiyama. 2007. A Real-Time Quantitative PCR Detection Method for Pork, Chicken, Beef, Mutton, and Horseflesh in Foods. Japan : Setagaya-ku, Tokyo. 71 (12). 3131-3135.2007
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Vaerman, J.L., P. Saussoy, I. Ingargiola. 2004. Evaluation of Real-Time PCR Data. Belgium : Cliniques Saint Luc, Bruxelles.
Weaver, F. Robert. 2004.Molecular Biology, second edition. Kansas : The McGraw-Hill.
Wijaya, Yoga Permana, 2009. Fakta Ilmiah tentang Keharaman Babi. Bandung.
http://yogapw.wordpress.com, diakses pada tanggal 25 April 2011 pukul 09.00 WIB
Yusuf, Zuhriana K. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek vol.5 No:6, 2010, FIKK-Universitas Gorontalo.
55 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 1. Alur Penelitian
Pengumpulan sampel bakso sapi secara
stratified random sampling
Isolasi DNA sampel dan DNA kontrol
DNA terisolasi DNA tidak
terisolasi
Hasil Analisis
Cek keberadaan DNA melalui Spektrofotometer UV untuk DNA
Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR Optimasi kondisi Real-Time PCR Kesimpulan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 2. Spesifikasi Kit isolasi DNA High Pure PCR Template Preparation (Roche)
Tabel 14. Spesifikasi Kit isolasi DNA High Pure PCR Template Preparation (Roche) No. Vial Waran Tutup Vial Label Kandungan
1 Putih Tissue Lysis Buffer 4 M urea, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 20 mM EDTA pH 7,4
2 Hijau Binding Buffer 6 M guanidin HCl,
10 mM urea, 10 mM Tris-HCl, 20% Triton X-100 (v/v) pH 4,4 3 Merah Muda Proteinase K Proteinase K
(Rekombinan, PCR Grade)
4a Hitam Inhibitor Removal
Buffer
5 M guanidin HCl, 20 mM Tris-HCl, 36% etanol absolut pH 4,4
4 Biru Washing Buffer 20 mM NaCl, 2
mM Tris-HCl, 80% etanol absolut (v/v) pH 7,5 5 Tidak Berwarna
(bening)
Elution Buffer 10 mM Tris-HCl pH 8,5
- - High Pure Filter
Tube
Tube berbahan polypropylene dengan filter yang terbuat dari kapas fiber glas. Dapat menampung 700 µl volume sampel
- - Collection Tube Tube berbahan
polypropylene, dapat menampung 2 ml volume sampel
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 3. Alur kerja Isolasi DNA menggunakan kit High Pure PCR Template Preparation (Roche)
50 mg jaringan ditimbang
add 200 µl Binding buffer
dan 40 µ l Proteinase K, campur segera, inkubasi pada 70oC selama 10 menit
add 100 µl isopropanol, campur homogen, masukkan ke filter tube, sentrifugasi selama 1 menit
pada 8000 x g
add 500 µl Inhibitor Removal Buffer
Buang air yang melewati filter dengan
collection tube nya
Sentrifugasi selama 1 menit
pada 8000 x g add 500 µl wash buffer
Buang air yang melewati filter dengan
collection tube nya
Sentrifugasi selama 1 menit
pada 8000 x g add 500 µl wash buffer
Buang air yang melewati filter dengan
collection tube nya
Sentrifugasi selama 1 menit pada 8000 x g Buang air yang
melewati filter
Sentrifugasi selama 1 menit pada 8000 x g
Add tube baru dan 200 µl
elution buffer (70oC) Buang collection tube Sentrifugasi selama 1 menit
pada 8000 x g
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 4a. Membuat larutan induk primer dan probe
1. Membuat larutan induk primer dan probe 100 µM (Alpha DNA) Jenis Nama oligo Jumlah DNA
(µg)
Penambahan Aquabidest untuk Membuat 100 µM Babi Forward 247,9 371 µL Reverse 294,6 382 µL Probe 46,2 65 µL Sapi Forward 293,0 491 µL Reverse 233,7 381 µL Probe 48,9 83 µL
2. Membuat larutan primer dan probe 10 µM dari larutan induk V1 . M1 = V2 . M2
X . 100 µM = 100 µL . 10 µM X = 1000
100 = 10 µL
Maka, 10 µL diambil dari masing-masing primer 100 µM dan di add 90 µL Aqua PCR grade
3. Rekomendasi konsentrasi untuk primer adalah 0.3-1 µM (Rochec), dipilih konsentrasi 0.8 µM untuk tiap primer
V1 . M1 = V2 . M2
X . 10 µM = 20 µL . 0,8 µM X = 16
10 = 1,6 µL
Maka, diambil 1,6 µ L dari larutan primer konsentrasi 10 µM
4. Rekomendasi konsentrasi untuk probe adalah 0.05-1 µM (Rochec), dipilih
konsentrasi 0.2 µM untuk tiap probe V1 . M1 = V2 . M2 X . 10 µM = 20 µL . 0,2 µM
X = 4 10 = 0,4 µL
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 4b. Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA
Tabel 16. Campuran reaksi master mix
Konsentrasi Lar.induk Jumlah yang digunakan
Primer Forward 0,8 µM 10 µ L 1,6 µ L Primer Reverse 0,8 µM 10 µ L 1,6 µ L Probe 0,2 µM 10 µ L 0,4 µ L Probe Master - - 10 µ L ddH2O - - 1,4 µ L DNA template - - 5 µ L
Total volume reaksi 20 µL
*Terdiri dari: - Fast Start Taq DNA Polymerase - Buffer
- dNTP (termasuk dUTP dan dTTP) - 6,4 mM MgCl
Lampiran 5. Perhitungan Tm (Melting Temperature) primer
Rumus Tm = 2oC (A+T) + 4 oC (G+C) Sapi = 2oC (2+8) + 4 oC (2+8) Babi = 2oC (6+5) + 4 oC (4+7) (Forward) = 2oC (10) + 4 oC (10) (Forward) = 2oC (11) + 4 oC (11) = 20oC + 40oC = 22oC + 44oC = 60oC = 66oC Sapi = 2oC (5+8) + 4 oC (6+5) Babi = 2oC (8+7) + 4 oC (6+4) (Reverse) = 2oC (13) + 4 oC (11) (Reverse) = 2oC (15) + 4 oC (10) = 26oC + 44oC = 30oC + 40oC = 70oC = 70oC
Primer sapi = 60oC + 70oC Primer babi = 66oC + 70oC
2 2
Tm = 65oC Tm = 66,5oC
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 6. Hasil Optimasi Suhu Annealing Primer Tanabe et al. dengan Metode Gradien PCR (Rahmawati, 2012) dengan modifikasi
Gambar 1. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer sapi pada untai DNA sapi dengan metode gradien PCR
Gambar 2. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer babi pada untai DNA babi dengan metode gradien PCR
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 7. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Sapi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0,5617
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 8. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Sapi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0,7500
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 9. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Sapi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0,9000
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 10. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Sapi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 1,330
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 11. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Babi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0,9000
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 12. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Babi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0,9400
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 13. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Babi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 1,3300
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 14. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Babi setelah modifikasi treshold dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 1,7330
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 15. Gambaran alat-alat yang digunakan dalam penelitian
Gambar 1. Real-Time PCR Gambar 2. Multiwell plate Gambar 3. Sealing Foil
Gambar 4. Kit Isolasi DNA Gambar 5. Spektro UV DNA Gambar 6. Microsentrifugator
Gambar 7. Timbangan Analitik Gambar 8. Vortex Gambar 9. Digital Water Bath