Saran - KESIMPULAN DAN SARAN - Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode Hydrolysis Prob

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.2 Saran

a. Diharapkan melakukan optimasi metode ekstraksi DNA pada gelatin agar mendapatkan DNA dengan nilai kemurnian 1,8 sampai 2,0.

b. Diharapkan untuk melakukan optimasi lebih lanjut dalam analisis DNA gelatin sapi dan DNA gelatin babi untuk mendapatkan kondisi optimal dalam mendeteksi, sehingga dapat dijadikan sebagai metode untuk pengujian kehalalan pada produk yang mengandung gelatin.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta DAFTAR PUSTAKA

Aida, A. A., Che Man, Y. B., Raha, A. R., & Son, R. 2007. Detection of pig derivatives in food products for halal authentication by polymerase chain reaction–restriction fragment length polymorphism. Journal of the Science of Food and Agriculture. Vol. 87. Hal: 569–572.

Ansel, Howard C. 2005. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Edisi keempat. Jakarta: UI-Press.

Arya, M., Iqbal S. Shergill, Magali Wiliamson, Lyndon Gommersall, Neehar Arya, dan Hitendra RH Patel. 2005. Basic Principle of Real-Time Quantitative PCR. Future Drugs Review Article. Vol. 5 No. 2, Hal: 209–

219

Atto. 2008. ATTO Printgraph AE-6933 Operation Manual. Tokyo: ATTO Corporation.

Azira, Nur T., Amin, I. dan Che Man, Y. B. 2012. Differentiation of bovine and porcine gelatins in processed products via Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) and principal component analysis (PCA) techniques. International Food Research Journal. Vol. 19 (3). Hal: 1175-1180

Balti, Rafik., J. Mourad, A. Sila, N. Souissi, N. Nedjar-Arroume, D. Guillochon, M. Nasri. 2010. Extraction and Functional Properties f Gelatin From The Skin of Cuttlefish (Sepia Officinalis) usiing Smooth Hound Crude Acid Protease-Aided Process. Artikel pada PressFood Hydrocolloids.

BioDrop. 2012. Quick Start Guide. http://www.biodrop.co.uk. Diakses pada tanggal 30 September 2014 pukul 20.30.

Bio-Rad. 2012. Protocols: Nucleic Acid Electrophoresis. Buletin 6230 Rev A. Bio-Rad Laboratories, Inc.

Cai, H., X. Gu, M.S. Scanlan, D.H. Ramatlapeng dan C.R. Lively. 2012. Realtime PCR assays for detection and quantitation of porcine and bovine DNA in gelatin mixtures and gelatin capsules. Journal of Food Composition and Analysis. Vol. 25. Hal: 83-87.

Campbell, Nail A., Reece, Jane B., Mitchell, Lawrence G. 2002. Biologi. Edisi Kelima Jilid 1, alih bahasa Rahayu Lestari. Jakarta: Erlangga

Carr, J. M., K. Sufferling, dan J. Poppe. 1995. Hydrocolloids and their use in the confectionery Industry. Journal of Food Technology. Vol. 32 (7). Hal: 41-42

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Chee Tan, Siun, dan Beow Chin Yiap. 2009. DNA, RNA, and Protein Extraction:

The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. Volume 2009, Article ID 574398.

Demirhan, Y., P. Ulca dan H.Z. Senyuva. 2012. Detection of porcine DNA in gelatine and gelatine-containing processed food products-Halal/Kosher authentication, Meat Science. Vol. 90. Hal: 686-689.

Edward, M. G., Ann Bickel dan Paul Weihs. 1996. Effect of highly fragmented DNA on PCR. Nucleic Acids Research, Vol. 24, No. 24. Oxford University Press.

Erwanto, Y., Abidin, M.Z., Sismindari, dan Rohman, A. 2012. Pig Species Identification in Meatballs Using Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism for Halal Authentication.

International Food Research Journal 19 (3): 901-906.

Gaffar, Shabrani, M.Si. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung: FMIPA-Universitas Padjajaran

Gjerse, D. T., L. Hoang, and D. Hornby. 2009. RNA Purification and Analysis: Sample Preparation, Extraction, Chromatography. Edisi ke-1. Germany: Wiley VCH,Weinheim.

Guillen, Gómez M.C., Pérez-Mateos, M., Gómez-Estaca, J., López-Caballero, E., Giménez, B., & Montero, P. (2009). Fish gelatin: a renewable material for the development of active biodegradable films. Trends in Food Science and Technology. Vol. 20. Hal: 3-16.

Hartati, Yeni W., Maksum, Iman P. 2010. Amplifikasi 0,4 kb Daerah D-Loop DNA Mitokondria dari Sel Epitel Rongga Mulut untuk Keperluan Forensik. Bandung: FMIPA-Universitas Padjadjaran.

Hashim, D.M., Y.B.C. Man, R. Norakasha, M. Shuhaimi, Y. Salmah dan Z.A. Syahariza. 2010. Potential use of Fourier transform infrared spectroscopy for differentiation of bovine and porcine gelatin. Food Chemistry. Vol. 118. Hal: 856-860.

Hidaka, S. dan S.Y. Liu. 2003. Effects of gelatins on calcium phosphate precipitation: A possible application for distinguishing bovine bone gelatin from porcine skin gelatin. Journal of Food Composition and Analysis. Vol. 16. Hal: 477-483.

Hinterwaldner, R. 1977. Technology of gelatin manufacture. The Science and Technology of Gelatin. London: Academic Press. Hal: 315–361.

Horton, H. Robert, Laurence A. Moran, K. Gray Scrimgeour, Marc D. Perry, J. David Rawn. 2006. Principles of Biochemistry. Edisi Keempat. USA: Pearson Education, Inc.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Ikada, Y. 2002. Biological Materials. Integrated Biomaterials Science. USA:

Academic /Plenium Publishers.

Jamaludin, M. A., Mohd. Anuar Ramli, Dzulkifly Mat Hashim. 2012. Fiqh Istihalah: Integration of Science and Islamic Law. Revelation and Science. Vol. 02, No.02

Jannah, A. 2008. Gelatin: Tinjauan Kehalalan dan Alternatif Produksi. Malang: UIN-Malang Press

Jones, B.E., 2004. The history of The Medicinal Capsule. Dalam: Podczeck, F., Jones, B.E. (Eds.). Pharmaceutical Capsules. USA: Pharmaceutical Press. Hal: 1–22.

Koolman, Jan dan Klaus-Heinrich Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry. Edisi Kelima. Germany: Georg Thieme Verlag

Lelana, Neo Endra, Sutarno dan Nita Etikawati. 2003. Identifikasi Polimorfisme pada Fragmen ND-5 DNA Mitokondria Sapi Benggala dan Madura dengan Teknik PCR-RFLP. Biodiversitas. Vol. 4 (1). Surakarta: FMIPA-Universitas Sebelas Maret

Lewis, Matt. 2001. Agarose Gel Electrophoresis (Basic Method).

http://www.methodbook.net/. Diakses pada tanggal 1 Oktober 2014 pukul 14.15.

LPPOM MUI. 2008. Halal Menentramkan Umat. Jurnal Halal No.72.

Morrison TB, Weis JJ, dan Wittwer CT. 1998. Quantification of Low-copy Transcripts Bay continuous SYBR Green I Monitoring During Amplification. BioTechniques 24. Hal: 954–958.

Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Edisi Kedua. Bogor: IPB Press

Nemati, M., M.R. Oveisi, H. Abdollahi dan O. Sabzevari. 2004. Differentiation of bovine and porcine gelatins using principal component analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Vol. 34. Hal: 485-492.

Nhari, R.M.H.R., A. Ismail and Y.B. Che Man. 2012. Analytical methods for gelatin differentiation from bovine and porcine origins and food products. Journal of Food Science. Vol. 71 Hal: 42-46.

Passarge, Ebenhard. 2007. Color Atlas of Genetics. Edisi Ketiga. New York: Thieme

Purves, William K., David Sadava., Gordan H. Orians., & Craig Heller. 2004.

Life: The Science of Biology. Edisi Ketujuh. United States of America: Sinauer Associates and W. H. Freeman

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Putra, Suhartono. 1999. Biologi Molekuler Kedokteran, editor: Suhartono Taat

Putra. Surabaya : Airlangga University Press.

Rabadiya, Bhavisha dan Paresh Rabadiya. 2013. Capsule Shell Material From Gelatin To Non Animal Origin Material. International Journal of Pharmaceutical Research and Bio Science (IJPRBS). Vol. 2(3). Hal: 42-71

Rachmawati, Putri. 2012. Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Dendeng Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat dengan Metode Amplifikasi DNA Menggunakan Real-Time PCR. SKRIPSI. Program Studi Farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Raven, Peter H., George B. Johnson, Kenneth A. Mason, Jonathan B. Losos, Susan R. Singer. 2008. Biology. Edisi Kesembilan. New York: McGraw-Hill Companies, Inc.

Republika. 2013. Ini Pernyataan Menkes Soal Obat Halal yang Disesalkan MUI

viawww.republika.co.id. Diakses pada tanggal 28 Desember 2013 Republika. 2014. MUI: Menkes Langgar Hak Asasi Konsumen via

http://www.republika.co.id. Diakses pada tanggal 28 Desember 2013 Roche^a. 2012. High Pure PCR Template Preparation Kit.

http://www.roche-applied-science.com. Diakses pada 13 Juni 2014 pukul 17.05

Roche^b. 2012. High Pure Technology and Silica Adsorption Kits. http://lifescience.roche.com. Diakses pada 22 September 2014 pukul 04.17

Roche^c. 2005. LightCycler® 480 DNA SYBR Green I Master. www.rocheapplied-science.com. Diakses pada 2 September 2014 pukul 10.30

Roche^d. 2008. LightCycler® 480 Probes Master. www.rocheapplied-science.com. Diakses pada 2 September 2014 pukul 12.30

Rochee_{. 2008.} The LightCycler® 480 Instrument Operator’s Manual. www.rocheapplied-science.com. Diakses pada 10 Juni 2014 pukul 15.05 Rowe, Raymond C., Paul J. Sheskey, dan Marian E Quinn. 2009. Handbook of

Pharmaceutical Excipients. Edisi Keenam. London: Pharmaceutical Press.

Riaz, M.N. dan M.M. Chaudry. 2004. Halal Food production. USA: CRC Press.

Sahilah, A. M., Mohd. Fadly, A. S. Norrakiah, A. Aminah, Wan Aida, W. M.

Ma’aruf, A. G dan Mohd. Khan, A. 2012. Halal market surveillance of soft and hard gel capsules in pharmaceutical products using PCR and

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

southern-hybridization on. International Food Research Journal 19(1): 371-375.

Sambrook, J., E.F. Fritsch dan T. Manuatis. 2001. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Edisi ketiga. New York: Cold Spring Harbour Lab. Press.

Schrieber, R., & Gareis, H. 2007. Gelatine Handbook: Theory dan Industrial Practice. Jerman: Wiley VCH Verlag GmbH dan Co. KGaA

Sharma, Himani et al,. 2005. Mutations in the mitochondrial DNA D-loop region are frequent in cervical cancer. Cancer Cell International 2005, 5:34.

Smith, Cindy J. dan A. Mark Osborn. 2008. Advantages and Limitations of Quantitative PCR (Q-PCR)-based Approaches in Microbial Ecology. Federation of European Microbiological Societies UK: Blackwell Publishing Ltd.

Stanley, J.P. 1976. Capsule: The Theory and Practice of Industrial Pharmacy. Diedit oleh L. Lachman, H.A. Lieberman, dan J.L. Kanig. Philadelphia, Lea & Febiger. Hlm 404 - 420.

Stansfield, William D., Jaime S.Colomé., Raúl J.Cano. 2003. Shaum’s Easy

Outlines: Molecular and Cell Biology. USA: McGraw-Hill Companies, Inc.

Vaerman, J.L., P. Saussoy, I. Ingargiola. 2004. Evaluation of Real-Time PCR Data. Belgium : Cliniques Saint Luc, Bruxelles

Venien, A. dan D. Levieux. 2005. Differentiation of gelatins using polyclonal antibodies raised against tyrosylated bovine and porcine gelatins. J. Immunoassay Immunochem., 26, 215-229.

Widyaninggar, A., Triwahyudi., Triyana, K., dan Ab.Rohman. 2012. Differentiation between porcine and bovine gelatin in commercial capsule shells based on amino acid profiles and principal component analysis.Indonesian J.Pharm Vol. 23 No. 2: 96-101 ISSN-p : 0126-1037

Westermeier, 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and Practice. New-Jersey: John Wiley & Sons inc.

Wink, M. 2006. An Introduction to Molecular Biotechnology: Molecular Fundamentals, Methods and Application in Modern Biotechnology, Germany: Wiley-VCH,Weinheim.

Yuwono, Triwibowo. 2009. Biologi Molekular. Jakarta : Erlangga

Zhang, G.F., T. Liu, Q. Wang, J.D. Lei, G.H. Ma dan Z.G. Su. 2008. Identification of marker peptides in digested gelatins by high

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta performance liquid chromatography/ mass spectrometry. Chin. J. Anal. Chem., 36, 1499-1504.

Zhou, P. dan Regenstein, J. M. 2005. Effects of Alkaline and Acid Pretreatments on Alaska Pollock Skin Gelatin Extraction. Journal of Food Science, 70(6): C392–C396.

Zyskind, J. W. dan S. I. Bernstain. 1992. Recombinant DNA Manual. Academic Press, Inc. California

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 1. Kerangka Penelitian

Gelatin Standard Daging Segar

Ekstraksi dan isolasi DNA

Analisa DNA hasil isolasi dengan Elektroforesis Agarosa

dan Spektrofotometri

Amplifikasi dengan Real Time PCR

Analisa Hasil DNA terisolasi? tidak ya Isolat DNA Kesimpulan

Daging Sapi Daging Babi Gelatin Sapi Gelatin Babi

Metode

SYBR Green

Metode

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 2. Perhitungan pembuatan larutan primer dan probe

1. Membuat larutan primer dan probe 10 μM dari larutan induk 100 μM

V1 . M1 = V2 . M2 X . 100 μM = 100 μL . 10 μM

X = 1000 100 = 10 μL

Maka, 10 μL diambil dari masing-masing primer 100 μM dan di add 90 μL

PCR water grade

2. Mengetahui volume primer dan probe yang diambil dari larutan primer dan probe 10 μM dalam pembuatan master mix

a) Rekomendasi konsentrasi untuk primer pada SYBR Green mastermix

adalah 0.3-1 μM (Roche), dipilih konsentrasi 0.5 μM untuk tiap primer. V1 . M1 = V2 . M2

X . 10 μM = 20 μL . 0,5 μM

X = 10 10 = 1 μL

Maka, diambil 1 μL dari larutan primer konsentrasi 10 μM

b) Rekomendasi konsentrasi untuk primer pada Hydrolysis Probe mastermix adalah 0.3-1 μM (Roche), dipilih konsentrasi 0.8 μM untuk

tiap primer. V1 . M1 = V2 . M2 X . 10 μM = 20 μL . 0,8 μM X = 16 10 = 1,6 μL

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta c) Rekomendasi konsentrasi untuk primer pada Hydrolysis Probe adalah

0.05-0.2 μM (Roche), dipilih konsentrasi 0.2 μM untuk tiap primer. V1 . M1 = V2 . M2

X . 10 μM = 20 μL . 0,2μM

X = 4 10 = 0,4 μL

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 3. Perhitungan Tm (Melting Temperature) Primer

Primer Sapi Primer Babi

Primer sapi forward

Tm = 2^oC (2+8) + 4^oC (2+8)

= 60o_C

Primer babi forward

Tm = 2^oC (6+5) + 4^oC (4+7)

= 66o_C

Primer sapi reverse

Tm = 2^oC (5+8) + 4^oC (6+5)

= 70o_C

Primer babi reverse

Tm = 2^oC (8+7) + 4^oC (6+3)

= 66o_C

Tm rata-rata Primer sapi: Tm = (60 + 70) / 2 = 65o_C

Ta* = 60^oC

Tm rata-rata Primer babi: Tm = (66 + 66) / 2 = 66o_C

Ta* = 61^oC

*) Suhu annealing yang digunakan biasanya 5o_{C di bawah Tm (Muladno, 2010)}

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 4. Campuran Reaksi Mastermix untuk Amplifikasi DNA

Tabel 7. Campuran reaksi SYBR Green mastermix

Konsentrasi Larutan Induk Jumlah yang digunakan Primer Forward 0,5 μM 10 μM 1 μL Primer Reverse 0,5 μM 10 μM 1 μL LightCycler® 480 SYBRGreen I - - 10 μL ddH2O - - 3 μL DNA template - - 5 μL

Total volume reaksi 20 μL

Tabel 8. Campuran reaksi Hydrolysis Probe mastermix

Konsentrasi Larutan Induk Jumlah yang digunakan Primer Forward 0,8 μM 10 μM 1,6 μL Primer Reverse 0,8 μM 10 μM 1,6 μL Probe 0,2 μM 10 μM 0,4 μL LightCycler® 480 Probe Master - - 10 μL ddH2^O ^- ^- ^1,4 μL DNA template - - 5 μL

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 5. Hasil Optimasi Suhu Annealing dengan Metode Gradien PCR

Gambar 1. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer sapi pada DNA daging sapi dengan metode gradien PCR (Sumber: Rahmawati, 2012)

Gambar 2. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer babi pada DNA daging babi dengan metode gradien PCR (Sumber: Rahmawati, 2012)

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 6. Spesifikasi kit ekstraksi dan isolasi DNA: High Pure PCR

Template Preparation Kit (Roche)

Tabel 9. Spesifikasi kit ekstraksi (Sumber: Rochea_{, 2012)}

No. Vial

Warna Tutup

Vial ^Label ^Kandungan

1 Putih Tissue Lysis Buffer

4 M urea, 200 mM Tris, 20 mM NaCl, 200 nM EDTA. pH 7.4.

2 Hijau Binding Buffer

6 M guannidine-HCl, 10 mM urea, 10 mM Tris-HCl, 20 % Triton X-100 (v/v). pH 4.4 3 Merah muda Proteinase K ^{Proteinase K (rekombinan,}

PCR grade)

4a Hitam Inhibitor Removal Buffer

5M guanidine-HCl, 20 mM Tris-HCl, 36% etanol absolut (v/v). pH 6.6

4 Biru Washing Buffer

20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, 80% etanol absolut (v/v). pH 7.5

5 ^{Tidak Berwarna}

(Bening) ^{Elution Buffer} ^{10 mM Tris-HCl, pH 8.5}

- - High Pure Filter Tube

Tube berbahan polypropylene dengan filter yang terbuat dari kapas fiber glass. Dapat

menampung 700 μl volume sampel. - - Collection Tube Tube berbahan polypropylene. Dapat menampung 2 ml volume sampel.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta Lampiran 7. Hasil Kurva Amplifikasi dan Melting Peaks dengan

Metode SYBR Green Menggunakan Primer Sapi dengan Suhu Annealing 60o_C