SEKOLAH PASCASARJANA INSITUT PERTANIAN BOGOR

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR

SEKOLAH PASCASARJANA INSITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2006

v Nama : Wiwin Imro’atun Khoiriyah NIM : P055020011

Disetujui Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Maggy T. Suhartono Dr. Agus Purwantara, APU

Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Bioteknologi Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Muhammad Jusuf Prof. Dr. Syafrida Manuwoto, MSc.

Penulis dilahirkan di Klaten, Jawa Tengah pada tanggal 24 Januari 1976 sebagai anak kedua dari pasangan Ayahanda H. Sihadi Abdul Ghofur dan Ibunda Sri Supeni.

Pendidikan dasar di SDN Jiwo, lulus tahun 1988. Pendidikan menengah di SMPN 1 Wedi, lulus pada tahun 1991 dan pada tahun 1994 penulis lulus dari SMAN 1 Klaten. Pendidikan sarjana ditempuh di Fakultas Biologi, Universitas Jenderal Soedirman, di Purwokerto lulus 1999. Pada tahun 2002 melanjutkan studi di Program Studi Bioteknologi Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Beasiswa pendidikan diperoleh dari program BPPS Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan Nasional.

vii

Puji dan syukur penulis panjatkan pada Allah SWT atas segala karunia- Nya sehingga penelitian dan penulisan tesis yang merupakan salah satu syarat untuk meraih gelar Magister Sains di Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor dapat diselesaikan. Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Mei 2004 sampai dengan Juli 2005, dengan judul “Overekspresi Gen Kitinase pada

Trichoderma harzianum Lokal ”.

Penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang sebesar- besarnya kepada Prof. Dr. Maggy T. Suhartono selaku ketua komisi pembimbing dan Dr. Agus Purwantara, APU selaku pembimbing anggota atas dorongan dan bimbingan selama penulis menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Dr. Darmono Taniwiryono selaku Pimpinan Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) yang telah memberi ijin untuk melakukan penelitian di Laboratorium Biologi Molekuler dan aboratorium Mikroba BPBPI. Terima kasih kepada Dr. Siswanto, Dr. Asmini, Dr. Djoko Santoso dan Dr. Tetty atas pengarahan dan kepedulian terhadap penulis selama menyelesaikan pendidikan pascasarjana di IPB. Kepada teman-teman teknisi Bu Endang, Topan, Niyyah, Herti dan Arif terima kasih atas kerjasama dan bantuannya. Tidak lupa terima kasih buat rekan-rekan seperjuangan Biotek 2002 (Diana, Berty, Roberdi, , Mbak Anik, Kusuma, Bang Molah), Ilyas Jamil, MSi dan Kiki atas bantuan, motivasi dan diskusi dengan penulis selama penelitian dan perkuliahan di IPB.

Penulis juga mengungkapkan terima kasih yang setulus-tulusnya serta syukur atas kesabaran dan doa Ayahanda H. Sihadi Abdul Ghofur dan Ibunda Sri Supeni, kakak-kakak dan adik-adikku tersayang, terima kasih untuk doa dan kasih sayang sehingga penulis dapat menyelesaikan studi dan penelitian. Untuk Mas Afdan Irvandy atas cinta dan kasih sayangnya selama menyelesaikan studi di IPB yang telah mencari dan memberi yang terbaik buatku.

Bogor, Mei 2006

viii

Halaman DAFTAR TABEL ... x DAFTAR GAMBAR ... xi DAFTAR LAMPIRAN ... xii

PENDAHULUAN ... 1 Latar Belakang ... 1 Tujuan ... 4 Manfaat Penelitian ... 4

TINJAUAN PUSTAKA ... 5 Penyakit Busuk Pangkal Batang Kelapa Sawit ... 5 Pengendalian Hayati Penyakit ... 5 Enzim Kitinase T. harzianum... 7 Konstruksi, Transformasi dan Overekspresi Gen Kitinase ... 9

BAHAN DAN METODE ... 12 Tempat dan Waktu Penelitian ... 12 Bahan dan Alat ... 12 Metode Pelaksanaan... 12 Alur Penelitian ... 12

Transformasi Gen Kitinase pada T. harzianum... 13 Triparental mating ... 14 Uji Konsentrasi Antibiotik untuk Seleksi Transformasi ... 14 Transformasi T. harzianum melalui A. tumefaciens... 15 Analisis Transforman ... 16

Isolasi DNA Genomik ... 16 Pelaksanaan PCR ... 16 Southern Blot ... 17 Sintesis Probe ... 18 Penentuan Efisiensi Pelabelan ... 18 Digesti DNA Genomik dan Blotting ke dalam Membran .... 19 Hibridisasi ... 19 Ekstraksi Enzim Kitinase ... 19

HASIL DAN PEMBAHASAN ... 21 Transformasi Gen Kitinase pada T. harzianum... 21

Triparental mating ... 21 Uji Konsentrasi Antibiotik untuk Seleksi Transformasi ... 22 Transformasi T. harzianum melalui A. tumefaciens... 24

Pelaksanaan PCR ... 26 Southern Blot ... 27 Uji Aktivitas Kitinase T. harzianum transforman ... 30

SIMPULAN DAN SARAN ... 34 DAFTAR PUSTAKA ... 35 LAMPIRAN ... 39

Halaman

Tabel 1 Pertumbuhan Trichoderma harzianum wildtype pada media PDA yang mengandung higromisin... 23

WIWIN IMRO’ATUN KHOIRIYAH

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2006

iii

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis ‘Overekspresi Gen Kitinase pada Trichoderma harzianum Lokal’ adalah benar-benar merupakan hasil karya sendiri dan belum pernah digunakan untuk memperoleh gelar sejenis. Semua sumber data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan secara jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.

Bogor, Mei 2006

Wiwin Imro’atun K NIM P055020011

WIWIN IMRO’ATUN K. Overekspresi Gen Kitinase pada Trichoderma harzianum Lokal. Dibimbing oleh MAGGY T. SUHARTONO dan AGUS PURWANTARA.

Kemampuan Trichoderma harzianum untuk menghambat pertumbuhan cendawan lain memungkinkannya efektif sebagai agen biokontrol cendawan

patogen pada tanaman. Ganoderma sp., yang menyebabkan busuk pangkal batang pada tanaman kelapa sawit merupakan salah satu patogen target penting

yang perlu dikendalikan. Ekspresi gen kitinase pada Trichoderma diketahui memegang peranan penting selama periode kontak awal pada proses mikoparasitik. Gen penyandi kitinase pada T. harzianum juga diketahui sebagai

gen dengan kopi tunggal. Tujuan penelitian ini adalah melakukan transformasi gen kitinase yang diklon dari T. harzianum isolat lokal DT41 ke T. harzianum

DT38 dan ekspresi gen kitinase pada transformannya. Konstruk gen kitinase disisipkan ke dalam Agrobacterium tumefaciens dengan membuat vektor biner pPK2trpChi yang membawa gen higromisin B phosphotransferase dari bakteri sebagai marker seleksi dan dikendalikan oleh promoter Aspergillus nidulans trpC.

Vektor ini kemudian ditransformasikan ke dalam T. harzianum DT38 menghasilkan beberapa transforman. Uji dengan PCR mengkonfirmasi keberadaan kaset gen di dalam genom transforman, tetapi uji Southern blotting

tidak berhasil mengkonfirmasi. Semua transforman yang diuji stabil secara mitotis, menunjukkan ketahanan terhadap hygromycin B setelah beberapa generasi. Namun demikian, hanya satu transforman yang memperlihatkan peningkatan aktifitas kitinasenya (9.6 uM pNP/mg protein/jam jika dibandingkan

Trichoderma harzianum_LOKAL

WIWIN IMRO’ATUN KHOIRIYAH

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR 2006

v Nama : Wiwin Imro’atun Khoiriyah NIM : P055020011

Disetujui Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Maggy T. Suhartono Dr. Agus Purwantara, APU

Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Bioteknologi Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Muhammad Jusuf Prof. Dr. Syafrida Manuwoto, MSc.

Penulis dilahirkan di Klaten, Jawa Tengah pada tanggal 24 Januari 1976 sebagai anak kedua dari pasangan Ayahanda H. Sihadi Abdul Ghofur dan Ibunda Sri Supeni.

vii

Trichoderma harzianum Lokal ”.

Bogor, Mei 2006

viii

Halaman DAFTAR TABEL ... x DAFTAR GAMBAR ... xi DAFTAR LAMPIRAN ... xii

PENDAHULUAN ... 1 Latar Belakang ... 1 Tujuan ... 4 Manfaat Penelitian ... 4

BAHAN DAN METODE ... 12 Tempat dan Waktu Penelitian ... 12 Bahan dan Alat ... 12 Metode Pelaksanaan... 12 Alur Penelitian ... 12

HASIL DAN PEMBAHASAN ... 21 Transformasi Gen Kitinase pada T. harzianum... 21

Triparental mating ... 21 Uji Konsentrasi Antibiotik untuk Seleksi Transformasi ... 22 Transformasi T. harzianum melalui A. tumefaciens... 24

Pelaksanaan PCR ... 26 Southern Blot ... 27 Uji Aktivitas Kitinase T. harzianum transforman ... 30

SIMPULAN DAN SARAN ... 34 DAFTAR PUSTAKA ... 35 LAMPIRAN ... 39

Halaman

Tabel 1 Pertumbuhan Trichoderma harzianum wildtype pada media PDA yang mengandung higromisin... 23

Halaman Gambar 1 Mekanisme mikoparasitisme Trichodermaharzianum pada patogen

tanaman Pythium sp. ... 6

Gambar 2 Peta plasmid biner pPK2-Trp-Chi... 11

Gambar 3 Alur kegiatan penelitian ... 13

Gambar 4 PCR pada koloni hasil Triparental mating dengan

primer nptII ... 22

Gambar 5 (A) Hasil seleksi transformasi pada media PDA + higromisin 300 µg/mL setelah 7 hari, (B) subkultur transforman pada media PDA+ higromisin 300 ug/mL berumur 2 hari... 25

Gambar 6 Morfologi koloni Trichoderma harzianum DT38 pada media PDA... 25

Gambar 7 Hasil amplifikasi dengan primer hph... 27

Gambar 8 Hasil isolasi fragmen gen chi... 28

Gambar 9 Efisiensi pelabelan probe chi... 29

Gambar 10 Hasil Southern Blot ... 30

Gambar 11 Grafik pengukuran aktivitas kitinase Trichoderma

xii

Halaman Lampiran 1 Komposisi beberapa pereaksi untuk isolasi DNA ... 39

Latar Belakang

Tanaman kelapa sawit merupakan komoditas perkebunan penting bagi Indonesia. Selain untuk memenuhi kebutuhan minyak goreng dalam negeri, kelapa sawit juga merupakan komoditas andalan ekspor non-migas dari sektor pertanian. Devisa yang diperoleh dari ekspor minyak dan inti minyak pada tahun 1993 mencapai US$ 692.817 juta (Direktorat Jenderal Perkebunan 1994). Selain itu perkebunan kelapa sawit juga mempunyai arti sosial yang penting, karena perkebunan ini merupakan penyerap tenaga kerja yang cukup besar. Menurut Asmono et al. (1999) areal perkebunan kelapa sawit di Indonesia pada tahun 1998 mencapai 2,6 juta hektar yang menghasilkan lebih kurang 5,9 juta ton minyak sawit mentah (CPO). Dari jumlah tersebut 3 juta ton diantaranya diekspor dengan nilai 1,5 juta miliar USD.

Perkebunan kelapa sawit mempunyai arti sosial yang penting karena dapat menyerap tenaga kerja yang cukup besar. Menurut Asmono et al. (1999), areal perkebunan kelapa sawit di Indonesia pada tahun 1998 mencapai 2,6 juta hektar dengan sekitar 34 % areal merupakan perkebunan rakyat dan sisanya diusahakan oleh pemerintah dan swasta. Pemerintah mentargetkan peningkatan produksi kelapa sawit secara nasional dan menjadikan Indonesia sebagai Negara pengekspor minyak sawit terbesar di dunia pada tahun 2010. Untuk itu berbagai upaya pendukung peningkatan produktivitasnya digalakkan dan salah satunya dengan mengendalikan hama dan penyakit pada areal perkebunan kelapa sawit.

Penyakit busuk pangkal batang yang disebabkan oleh Ganoderma merupakan penyakit paling penting pada kelapa sawit. Penyakit ini menimbulkan kerugian sampai 17-171 juta US dalam per tahun (Darmono et al. 1997). Ada beberapa cara mengendalikan patogen penyebab penyakit yaitu menggunakan pestisida/bahan kimia aktif yang diaplikasikan langsung pada areal tanaman yang terserang, merakit tanaman transgenik yang mengekspresikan gen anti patogen yang diintroduksikan ke dalamnya, atau mengembangkan mikroba parasit yang bersifat antipatogen.

Sekarang ini kebanyakan petani masih menggunakan pestisida kimiawi untuk menanggulangi serangan hama dan penyakit pada tanaman budidaya, meskipun dapat menimbulkan dampak merugikan terhadap kesehatan, keamanan produk pertanian maupun resiko lingkungan yang lain (Purwantara 2003). Metode lain yang dapat dikembangkan adalah perakitan tanaman transgenik yang mampu mengekspresikan gen penyandi enzim antipatogen. Dalam usaha perakitan tanaman transgenik diperlukan sumber gen antipatogen yang diintroduksikan melalui transformasi ke dalam tanaman dengan menggunakan teknik kultur jaringan. Proses ini lebih rumit dan diperkirakan kemampuan beberapa generasi tanaman transgenik tersebut akan mudah patah, baik karena ketidakstabilan gen terintroduksi dalam genomnya maupun adanya mutasi dari patogen untuk mempertahankan diri. Dengan demikian pengembangan pengendalian hayati (biokontrol) patogen menggunakan organisme yang antagonis merupakan mekanisme pengendalian terhadap penyakit tanaman non kimia yang potensial.

Aplikasi Streptomyces anulatus yang mempunyai aktivitas kitinase, efektif mengendalikan patogen layu Fusarium pada tanaman tomat dan strawberi. Demikian juga aplikasi Kurthia zopfii terhadap penyakit embun tepung (Erysiphe graminis f. sp. Hordei) pada gandum-barlei, serta aplikasi Serratia marcescens terhadap Rhizoctonia

solani pada tanaman kapas dan Sclerotium rolfsii pada tanaman kacang. Bahkan

efektivitas aplikasi klon Escherichia coli pembawa gen kitinase dari K. zopfii tidak berbeda nyata dengan K. zopfii-nya sendiri (Priyatno et al. 1997). Cendawan T.

harzianum mampu menghambat berbagai cendawan patogen pada tanaman perkebunan

antara lain Ganoderma sp. pada akar kelapa sawit, penyakit akar putih pada tanaman karet dan Phytopthora sp. pada tanaman kakao.

Indonesia memiliki kekayaan sumber gen yang melimpah baik yang berasal dari mikroba, tanaman dan hewan yang belum banyak dimanfaatkan. Keberadaan sumber gen asal Indonesia memiliki arti yang sangat strategis karena dapat mengurangi ketergantungan kita dari negara-negara lain terutama negara maju yang mendominasi kemajuan di bidang bioteknologi (Minarsih et al. 2002). Saat ini di laboratorium mikroba Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia (BPBPI) telah diisolasi beberapa isolat Trichoderma spp. yang diketahui efektif untuk mengendalikan cendawan. Isolat tersebut diantaranya adalah Trichodermaharzianum isolat lokal DT38 dan DT41, yang

diketahui memiliki aktivitas kitinase dan tingkat virulensi yang tinggi terhadap cendawan patogen Ganoderma sp. Ketika dikulturkan, isolat DT38 menghasilkan spora yang lebih banyak daripada isolat DT41, tetapi isolat DT38 mempunnyai aktivitas kitinase yang lebih rendah. Salah satu kriteria pengembangan mikroba sebagai pengendali hayati adalah kemampuannya untuk ditumbuhkan dengan baik (spora yang dihasilkan banyak), maka isolat T. harzianum DT38 merupakan isolat asal Indonesia yang telah dikembangkan secara komersial sebagai biofungisida. Isolat tersebut di lapangan telah terbukti memiliki kemampuan yang cukup besar dalam menghambat pertumbuhan beberapa cendawan patogen termasuk Ganodermaboninense.

Dalam rangka pengembangan biofungisida T. harzianum sebagai pengendali hayati patogen G. boninense dilakukan studi awal untuk mentransformasi gen kitinase asal T. harzianum DT41 ke dalam genom T. harzianum DT38. Sebagai upaya peningkatan resistensi tanaman kelapa sawit terhadap patogen, gen kitinase asal T.

harzianum isolat lokal DT41 terklon juga dapat menjadi sumber gen untuk kegiatan

transformasi ke tanaman kelapa sawit.

Menurut Purwantara (2003), keberhasilan pengendalian hayati terhadap patogen dipengaruhi pula oleh perkembangan dari mikoparasit yang superior. Untuk memperoleh mikoparasit yang superior, salah satu pendekatan yang ditempuh adalah memproduksi strain transgenik dengan sifat antagonisme yang lebih mantap. Rekayasa genetika cendawan sebagai agen pengendalian hayati melalui overekspresi gen penyandi enzim yang mampu menghambat pertumbuhan patogen telah dilaporkan. Sebagai contoh Carsolio et al. (1999) telah meneliti peranan endochitinase T. harzianum dengan manipulasi genetik pada gen penyandi ECH42 yaitu ech42 dengan mengkonstruksi beberapa strain T. harzianum transgenik yang membawa multi kopi ech42. Gen penyandi endochitinase ini merupakan gen dengan kopi tunggal (Garcia et al. 1994; Lora et al. 1995) dan biosintesis enzimnya terutama dikontrol pada level transkripsi (Garcia et al. 1994; de la Cruz et al. 1995). Strategi peningkatan jumlah kopi gen penyandi endochitinase diharapkan dapat pula meningkatkan produksi enzim kitinasenya dan selanjutnya akan menambah aktivitas penghambatan terhadap patogen target.

Kloning gen kitinase dari Trichoderma harzianum galur DT41 isolat lokal telah berhasil dilakukan dengan metode PCR menggunakan primer spesifik dari sekuen gen penyandi endochitinase 42 dari Hayes et al. 1994. Amplikon berukuran sekitar 1.5 kb disubkloning dan hasil sekuensing memperlihatkan homologi yang tinggi dengan gen kitinase pada database (Purwantara 2003). Fragmen gen chi terklon disubkloning ke dalam plasmid pPK2-Trp-Chi yang digunakan untuk transformasi ke dalam T. harzianum

lokal DT38 dengan bantuan A. tumefaciens strain AGLO.

Tujuan penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk 1). melakukan transformasi gen kitinase ke dalam

T. harzianum DT38 melalui A. tumefaciens, 2). menguji stabilitas kaset gen terintroduksi pada genom transforman dan 3). menguji ekspresi gen kitinase T. harzianum

transforman.

Manfaat penelitian

Aplikasi penegendali hayati menggunakan mikroba telah banyak dilaporkan baik oleh penelitian internasional maupun penelitian di Indonesia. Demikian pula Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia telah memproduksi beberapa pupuk hayati berbasis mikroba. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan peningkatan kemampuan

T. harzianum sebagai pengendali hayati terhadap patogen G. boninense pada kelapa

Dalam dokumen Overekspresi Gen Kitinase pada Trichoderma harzianum Lokal (Halaman 55-78)